缝隙连接蛋白CX32在颞叶癫痫患者海马中的表达及生胃酮的抑制作用

秦 哲， 田庆华， 姚丽芬

癫痫(epilepsy)是中枢神经系统常见慢性疾病，临床以反复发作性、短暂性、刻板性的中枢神经系统功能丧失为特征，其电生理表现为脑部神经元过度同步放电，每次发作称为痫样发作。据流行病学调查，一般人群的年患病率为是5‰～7‰，活动性癫痫患病率(5年内有发作)为4.6‰，我国估计难治性癫痫不少于100万。颞叶癫痫(temporal lobe epilep sy，TLE)是常见的一型药物难治性癫痫，约占药物难治性癫痫的60% ～80%左右，通过手术切除致痫灶治疗颞叶癫痫可获得较满意的疗效，其主要病理改变在边缘系统，尤其是海马的病变，海马硬化是颞叶癫痫最常见的病理类型。颞叶癫痫伴海马硬化者约占颞叶癫痫患者总数的58% ～60%，其主要病理表现为神经元脱失和胶质细胞增生。通过对癫痫的发生及发展机制的研究有利于治疗颞叶癫痫，减少患者的痛苦。

本实验选取颞叶癫痫患者术中切除的海马组织，用免疫组织化学方法观察CX32蛋白表达，同时我们对颞叶癫痫患者脑片应用生胃酮及传统抗癫痫药物丙戊酸钠进行处理，用Western-blot方法观察处理后组织中CX32表达的变化，探讨缝隙连接蛋白在癫痫发病机制中的作用以及生胃酮对缝隙连接蛋白表达的影响，以期对癫痫的干预和控制提供新的视点，寻找开发抗癫痫新药的适宜靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 癫痫组海马标本选自哈尔滨医科大学第一临床医学院神经外科手术治疗的14例颞叶癫痫患者，该患者均有癫痫发作的典型表现和脑电图特征，发作类型符合国际抗癫痫联盟1981年有关癫痫发作分类的规定，同时符合以下纳入标准:(1)用两种以上一线抗癫痫药(卡马西平、丙戊酸钠、苯妥英钠、苯巴比妥)治疗，且血药浓度在有效范围内，发作次数与用药前比较没有明显减少;(2)头部CT、MRI及相关的实验室检查未发现颅内肿瘤或其它进行性神经系统疾病;(3)术前评估无手术禁忌症，手术中脑电监测有明显的痫性放电灶，并能进行手术者;(4)患者本人及家属要求或同意手术治疗，术前签署知情同意书。其中男8例，女6例，年龄11～43岁，平均22.1±6.3岁;病程3～23年，平均9.2±5.5年;近6个月发作频率4～36次/m，平均21.3±10.1次/m。对照组8例因其他疾病死亡进行尸检者相应部位的病变海马脑组织，死者生前无癫痫发作。两组间年龄、性别、发作时间和切除海马部位临床资料比较分析没有显著性差异(P ﹥0.05)。

1.1.2 实验分组 免疫组化实验部分分组:癫痫组及对照组，两组标本选取同上。Western-blot实验部分分组:共分4组:癫痫组、癫痫+生胃酮组、癫痫+丙戊酸钠组、对照组。

1.2 实验方法

1.2.1 普通免疫组织化学染色方法(辣根过氧化物酶法)

1.2.1.1 标本收集和保存 术中切除海马组织术中取出后，按解剖分区法，选取含齿状回区的海马亚区待用，免疫组化和HE染色标本置于4%多聚甲醛和15%的苦味酸中室温下过夜，再移入含25%蔗糖的PBS中，4℃浸泡至组织块沉底，随后常规石蜡包埋切片，常温保存备用;对照组标本处理同上。

1.2.1.2 实验方法 切片前准备:(1)切片、捞片。捞出后的片子，放于56℃台上晾干。(2)鼓风干燥箱干燥＞15min后取出，放置过夜。步骤:(1)烤片1h;(2)二甲苯脱蜡(3个，各20min);(3)酒精水化;(4)自来水冲3遍(注意:自来水淋到载破片边缘以免组织被冲掉)后蒸馏水涮洗3遍;(5)H2O210min，消除内源性过氧化氢酶活性;(6)自来水冲3遍，蒸馏水冲3遍，PBS泡2～3min;(7)高压修复:待水沸腾后放入盛有枸橼酸(pH值=6.0)的高压锅，盖盖，大小浮子阀跳起后放上安全阀，160度，等安全阀旋转冒气后，换挡到120度，计时间2min30s，关开关，拔电源，自然冷却。自来水冲3遍，蒸馏水冲3遍;(8)曲拉通溶液10min;(9)PBS冲洗后，用力甩干，画道，滴加一抗(浓度为1:50)于切片，放入恒温箱1h;(10)取出后自来水冲3遍，PBS冲3遍，用力甩干;(11)滴加二抗(浓度为1:100)，恒温箱 30min，水冲，PBS冲;(12)带手套，加DAB显色液(1ml蒸馏水加试剂个一滴，按试剂顺序，A、B、C滴加)，光镜下观察，水冲，冲洗要充分;(13)苏木素复染3min;(14)1%盐酸酒精分化一下，自来水(热)返蓝;(15)酒精脱水;(16)中性树胶封片。

1.2.1.3 免疫组化结果判定方法及统计分析

在不知背景资料的情形下，采用双盲法进行。各脑组织切片均在同一水平，每隔3张切取1张，各组织均取6张，每张切片数5个视野阳性着色细胞，然后取其平均值。对照组选取断面水平相似的组织切片。所有切片在同一强度同一放大倍数下进行。实验数据均用χ±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为有差异。统计学分析用SPSS 12.0统计软件进行。

1.2.2 Western-blot分析

1.2.2.1 脑片制备 (1)癫痫患者海马组织术中取出后，迅速放入冰冷蔗糖脑脊液中，脑脊液通入95%O2～5%CO2的混合气体，配置后的脑脊液其调节渗透压应为300～315mOsm，pH值为7.4;(2)用组织胶将海马组织固定于震动切片机支架上，几秒钟后待组织完全固定，将其浸于震动切片机内冰冷的ACSF中。切片时推进速度范围为0.14～2mm/s，尽量选低速前进，减少刀片对组织的挤压损伤，震动频率范围为60～4500r/min，一般用3500r/min，先弃掉组织上端的不规则部分。(3)选取海马齿状回位置，以400um间隔在蔗糖脑脊液中沿海马水平位切海马脑片，每片400um。切下的脑片用软毛笔移至冰盒中的含氧冰冷ACSF的多孔培养皿中。(4)将所选脑片移至3个培养皿中，培养皿溶液换蔗糖脑脊液，持续通入95%O2～5%CO2的混合气体，1号培养皿加0.3mol/L mVPA，2号培养皿加200μmol/L Carb，3号培养皿不给予加药，4号培养皿内放正常对照脑片。(5)9h于4个培养皿各取出若干脑片，分别择取1～2片观察细胞形态，同时进行电流膜片钳纪录，以证实脑片存活。脑片置于-80℃冰箱保存行Western-blot实验。

1.2.2.2 Western-blot实验 (1)蛋白提取 ①取冻存裂解液一管(990ul)加10mlPMSF，摇晃混匀，与术中所取海马组织放在一起，放入冰盒内，冰盒置于冰上，样品从冰盒中取出融化后应用0.9%NaCl小心洗脱培养液颜色，将NaCl轻轻吸除干净，每管加入混匀后裂解液100ul，每个样品标记好后将1mlEP管放入4℃冰箱裂解1.5h左右;②取出样品与高速冰冻离心机中，4℃ 1000r离心10min，取上清液;③样品蛋白含量测定;(2)电泳:①配10%过硫酸铵1ml;配液1+1ml去离子水过硫酸铵;配液1×电泳液+900ml去离子水;配液1×转膜液+100ml储存液+200甲醇+700ml去离子水;②配10%分离胶5ml铺胶。配胶前装好胶板，架子上固定，尽可能使胶板与橡胶条接触紧密，TEMED加入后将胶吹打均匀，缓慢加入到胶板中间，加入量大致到距离薄胶板上边缘0.6～0.8cm处，加水封，凝胶时间大约在20～30min，看胶与水封间的印痕出现;③配积层胶2ml，再加分离胶铺好20～30min左右，胶与水封印痕出现时配制积层胶;④去梳子，上装电泳槽。积层胶完全凝好后，去梳子将胶与板与电泳配板按正确的方法卡到电路板上，对准后放入内槽卡好。将槽内卡入外槽中，内槽加电泳液至槽胶板上缘齐平，以检查是否漏液;⑤上样，按50μg蛋白量上样，即对照组为 8μl，颞叶癫痫组为 11μl，marker每孔加2ml;⑥电泳，在外槽加入电泳液，液面低于内槽2～5cm，积层胶电泳加70V恒压，约20min左右;分离胶电泳加110V恒压，约30min左右;(3)①转膜，将转膜板打开，分开海棉，滤纸用玻璃棒轻轻压好，然后将膜覆于胶上，同样用玻璃棒赶压去气泡，将上层滤纸覆盖好，赶压气泡，扣好转膜板放入转膜槽。电压150V，约70min左右;②洗膜:转膜结束后用镊子取出膜放入盛有PBS-T的自制塑料小槽中，置于TS-1000、ORB2AL、SHAKER 上振荡洗膜 3次，90转/min，每次6min;③杂交一抗 将抗体于 Primary Antibody Dilution Buffer中稀释，比例为1:1000。将膜从Blocking Buffer取出，放于一抗液中，室温孵育1h;④洗膜一抗杂交完毕后，吸出抗体液，按前方法洗膜3次;⑤杂交二抗 将膜取出放于1×TBS中孵育30min，每5min换一次液体。将膜置于二抗中，稀释比例为1:1000，室温孵育1h;⑥显色 将膜从二抗中取出，放于1×TBS中孵育30min，用滤纸吸干液体;⑦洗膜杂交完毕，吸出二抗，先用PBS-T洗二遍，6min/次，然后用 PBS洗 3遍，6min/次;⑧显色使用ECL显色剂显色，洗片。胶片经透射扫描仪扫描后获得图像。

1.2.2.3 Western-blot结果判定及统计学分析

Western-blot检测结果胶片经透射扫描仪扫描后获得图像，应用Image-pro-plus图像分析系统对图片进行半定量研究，测定待测蛋白与内参照蛋白的灰度值，两组间比值进行比较。所测数据用χ±s表示，统计学分析采用SPSS11.0软件进行;多样本间均数比较采用One-way ANOVA检验，两组间比较用t检验，P＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

在癫痫组和对照组海马组织中均可以检测到缝隙连接蛋白Cx32阳性细胞，且主要在神经元胞体及轴突均有表达，胞浆或胞膜内可见褐色颗粒表达，对照组表达弱。癫痫组表达量较对照组增强。经统计学处理，两组间差异均有统计学意义(P＜0.05，见表1、图 1)。

表1 Cx32免疫组化染色结果(χ±s)

2.2 Western-blot结果

癫痫组与癫痫+丙戊酸钠组缝隙连接蛋白Cx32的表达明显增高，两者之间比较无统计学意义(P＞0.05)，癫痫组、癫痫+丙戊酸钠组两组较癫痫+生胃酮组、对照组缝隙连接蛋白Cx32的表达明显增高，有统计学意义(P＜0.05)，而对照组与癫痫+生胃酮组两组缝隙连接蛋白CX32的表达无统计学差异(P ＞0.05)(见表2)。

图1 免疫组化结果(×400)

表2 Cx32海马Western-blot检测结果 (IOD)(χ±s)

3 讨论

缝隙连接(gap junction，GJ)作为细胞膜上的一种特殊结构，小分子物质及一些信息离子经该通道进行细胞间的转运，是相邻细胞间的通讯通道，缝隙连接参与了细胞间电信号传递的电耦联和物质交换的代谢耦联，对细胞的新陈代谢、、增殖和分化、内环境稳定等生理过程有一定的调控作用。同时它还参与整合胶质细胞的活动和传递第二信使，另外，缝隙连接允许离子如钾离子、钠离子、一些其他小分子物质及钙离子等通过而直接进行物质信息交换。故在神经元快速同步化、神经元电活动的维持、神经元的发育中起到重要的作用，由于缝隙连接是电突触的结构基础，缝隙连接促使相邻细胞之间形成同步化活动造成异常放电在癫痫的发生和发展中起到一定的作用。

我们在实验中发现颞叶癫痫患者海马中神经元脱失，数量明显减少，考虑在癫痫发生早期，由于缝隙连接蛋白表达增多，增加了电耦联及代谢耦联，并且促进小分子物质的信号传递，促进细胞凋亡，故而缝隙连接蛋白有损伤作用。在中枢神经系统内缝隙连接蛋白起到非常重要的作用，这些作用已经被大量的研究所证实。中枢神经系统内的神经元之间的缝隙连接在信号传递等方面起到相当重要的作用。如Ca2+、三磷酸肌醇(IP3)、环磷酸腺苷(cAMP)等小信号分子可以通过胞膜上的缝隙连接在相邻的两个细胞之间互相传递。有研究表明，通过缝隙连接IP3可以诱导细胞凋亡。Szalai等1报道，在细胞受到生长因素剥夺、缺氧等促凋亡因素刺激下，IP3与位于内质网上的IP3受体结合并且能都大量的产生，内质网内的大量的Ca2+释放到线粒体，使线粒体渗透性孔开放，导致大量释放细胞色素C，caspase激活，最终导致细胞凋亡。另外有观点认为，IP3能够对线粒体细胞色素C的释放起放大作用。细胞色素C从线粒体开放的渗透性孔大量释放后，与IP3受体结合，从而阻止了IP3受体抑制钙的作用，最终促进了Ca2+依赖性的凋亡，从而形成恶性循环。然而这种促凋亡的作用在给予缝隙连接阻滞剂后就会消失不见。另外缝隙连接蛋白有促进同步化放电的功能，在海马中同时存在很多的兴奋传入纤维和传出纤维，这些兴奋性纤维的存在极容易产生同步化放电，Nikolaus等2对正常的野生型大鼠与Cx36基因剔除大鼠做对比研究，发现在剔除Cx36基因的海马脑片中，测得由4-氮基吡啶引起的癫痫放电减少，而且高频震荡的频率明显降低，而在给予持续的强直刺激下，正常的海马脑片中能够引起高频震荡。由此可见，海马内Cx36能够促进同步化放电发生。少突胶质细胞中缝隙连接的主要作用是营养髓鞘，同时具有促进凋亡的作用。在少突胶质细胞Cx32是最早被检测出来的连接蛋白，它在华勒变性和髓鞘发育、轴突再生时表达。有研究发现，在剔除Cx32的转基因大鼠中发现其神经传导速度也会明显下降，髓鞘很稀疏。缝隙连接在细胞凋亡过程中究竟是起到促进作用还是抑制作用仍存在很多争议。在有些研究中发现，缝隙连接可以通过“旁观者效应”来诱导细胞凋亡。Udawatte等3的研究发现，在凋亡细胞培养基中，应用细胞色素C来诱导细胞凋亡，(细胞色素C一种线粒体衍生的凋亡蛋白)，将通过Cx32相耦联的两细胞中的一个细胞放在含有细胞色素C的磷酸盐缓冲液中孵育2h，然后将另一个细胞放在同一个培养基中，TUNEL染色发现，虽然细胞色素C不能够通过缝隙连接，但却能够使相邻的细胞也发生凋亡，而且应用缝隙连接阻滞剂能够明显阻断这种诱发相邻细胞凋亡的效应。甲碘荷包牡丹碱(bicuculline methiodide，BMI)为γ-氨基丁酸A型受体(GABAA)的拮抗剂，Samoilova等4将BMI处理海马CA1区的锥体细胞层，细胞外记录方法发现癫痫样放电，结果可见细胞膜的Cx32 mRNA和Cx43 mRNA的表达增高，缝隙连接起促进癫痫的形成作用。我们试验发现主要在神经元表达的Cx32的表达也是增加的，这种增加时在神经元大量减少的情况下发生的，那么可见单个神经元中的Cx32的表达是很强的，这种长期癫痫形势下出现的Cx32的表达略增多，增加了神经元之间的电突触传递，促进神经元的同步电活动。

本实验显示难治性癫痫患者海马中Cx32蛋白的表达量增多，星形胶质细胞增生，神经元减少。缝隙连接蛋Cx32的表达有实验结果表明为减少。与我们的实验结果不完全一致，考虑为反复痫性损伤因素的存在，最终导致神经元大量的死亡和脱失，神经元的数量和功能发生了变化，主要在神经元表达的Cx32的表达量也随之可能减少，但仍有待证实。另外有研究发现构成星形胶质细胞之间的缝隙连接蛋白CX43 mRNA表达明显升高，而构成神经元之间的缝隙连接蛋白CX32 mRNA的变化不明显。考虑可能的原因是癫痫发生部位的脑组织神经元过度同步化放电，使释放到细胞外的K+增加，星形胶质细胞为了清除过多的K+，使CX43 mRNA表达代偿性的增加，星形胶质细胞之间的缝隙连接数目增加，使清除K+的面积增加。有利于维持神经元的正常的微环境。Cx32的表达增高促进了神经元缝隙连接的形成，间接的增加了新的电突触数目并增强了电传导性，导致神经元同步化放电扩大。故神经元中表达最多的Cx32以及在星形胶质细胞中表达最多的Cx43可能在促进神经元的同步放电并导致癫痫持续发生中起到主要作用。

另外，本实验发现给予生胃酮干预后Cx32的表达明显减少，与对照组相比较无明显差异，而传统抗癫痫药物丙戊酸钠的干预却无明显影响。生胃酮是一种甘草酸的合成衍生物，临床用来治疗胃溃疡。有学者发现生胃酮能很好地抑制痫样放电及痫性发作。Velazquez等5应用原位末端标记技术(the method of TclT mediated dUTP2biotin nick end labeling，TUNEL)染色的方法，用缝隙连接阻滞剂甘珀酸作用于脑部短暂性缺血的大鼠模型，结果发现与未注射GJ阻滞剂甘珀酸的大鼠相比，其阳性细胞数明显减少，说明应用缝隙连接阻滞剂具有一定的减轻脑损伤的作用。Ross等6观察大鼠海马脑片发现，生胃酮会延长痫样放电潜伏期，减轻痫样放电程度。我们推测生胃酮可能阻断了缝隙连接耦连和降低了Cx32的合成，从而抑制了由缝隙连接导致的损伤传递，降低了癫痫的发作程度，具有明显的保护作用。而丙戊酸钠并不影响Cx32的表达，可见传统抗癫痫药物丙戊酸钠的抗癫痫机制与缝隙连接无关，缝隙连接具有独立于传统化学性突触的致痫机制。这与既往研究所标明的缝隙连接是传统化学性突出的补充，而不是替代结构相一致。

4 结论

缝隙连接蛋白Cx32蛋白在难治性颞叶癫痫患者海马脑组织中表达明显增强。Cx32的表达增高促进了神经元缝隙连接的形成，间接的增加了新的电突触数目并增强了电传导性，导致神经元同步化放电扩大。故神经元中表达最多的Cx32可能在促进神经元的同步放电并导致癫痫持续发生中起到主要作用。

给予生胃酮可以明显抑制CX32的表达，应用丙戊酸钠并不能对缝隙连接的表达产生影响，说明传统抗癫痫药物丙戊酸钠的抗癫痫机制与缝隙连接无关，缝隙连接具有独立于传统化学性突触的致痫机制，开发作用于缝隙连接通道的药物有可能成为治疗癫痫的新方法。

［1］Szalai G，Krishnamurthy R，Hajnoczky G.apoptosis driven by IP(3)-linked mitochondrial calcium signals［J］.EMBO J，1999，1(8):6349-6361.

［2］Nikolaus M，Martin G.Reduction of high2frequency network oscillations(ripples)and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 362deficient［J］.Mice J Phys，2002，541(2):521-528.

［3］Udawatte C，Ripps H.The spread of apoptosis through gap junctionalchannels in BHK cells transfected with Cx32［J］.apoptosis，2005，10(3):1019-1029.

［4］Samoilova M，Li J，Pelletiet MR，et al.Epileptiform activity in hippocampal slice cultures exposed chronically to bicuculline:increased gap junctional function and expression［J］.J Neurochem，2003，86(7):687-699.

［5］Velazquez JL，Kokarovtseva L，Sarbaziha R，et al.Role of gap junctional coupling in astrocytic networks in the determination of global ischaemia induced oxidative stress and hippocampal damage［J］.Neurosci，2006，23(2):1-10.

［6］Ross F M，Gwyn P，Spanswick D，et al.Carbenoxolone depresses spontaneousepileptiform activity in the CA1region of rat hippocampal slices［J］.Neuroscience，2000，100(4):789-796.