ATP结合盒转运子1 R219K基因多态性与脑梗死OCSP分型的关系

周中华， 肖志杰， 邓 可， 潘金保， 张 咏， 王 鹏

随着我国人口老龄化程度的逐步加深，脑血管疾病的发病率逐年升高，全国每年新发病例250万，死于脑血管病超过150万，幸存者600万～700万，残疾率高达75%，目前脑血管病年增长率高达8.7%，中青年脑梗死的发病率也呈逐年升高趋势［1，2］。脑梗死是脑血管疾病中最常见的类型，其发病率在脑血管病中高达60% ～80%［3］，脑梗死由于其高发病率，高致死率、高致残率而给社会和家庭带来沉重的负担。动脉粥样硬化性血栓性脑梗死是脑梗死中最常见的类型，其基本病因为动脉粥样硬化。研究表明高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的高水平能防止动脉粥样硬化从而减少脑血管病的发生［4，5］。临床和动物实验证实［6］，三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ABCA1)是在合成HDL-C的起始步骤中起重要作用的一类跨膜糖蛋白，在胆固醇代谢，清除组织内过多胆固醇，抗动脉粥样硬化等方面发挥决定性作用。ABCA1R219K是ABCA1基因的重要的单核苷酸多态性，研究［7］表明R219K可减轻冠状动脉粥样硬化的严重程度。同时有研究［8～11］表明，R129K的功能受到性别、年龄、种族、环境等多方面因素的影响。本实验选取ABCA1 R219K基因多态性与脑梗死关系进行研究。脑梗死OCSP分型主要通过患者发病时的临床表现进行分型，不依赖于影像学检查，专业医务人员之间诊断一致性高，本研究对ABCA1 R219K与中国湖南地区汉族人群血脂水平、不同OCSP分型脑梗死相关性进行病例对照研究。

1 资料和方法

1.1 研究对象 279例脑梗死患者来源于2001年2月～2002年11月在湘雅二医院神经内科住院的脑卒中患者。脑梗死组包括部分前循环梗死173例，后循环梗死29例，腔隙性梗死77例，未收集到完全前循环梗死病例，其中男性162例，女性117例，平均年龄62.5±11.4岁。脑梗死患者均符合全国第四届脑血管病会议修订的脑梗死诊断标准［3］。351例正常对照组，为长沙市雨花区普查和同期门诊体检的非心脑血管疾病人群，其中男性201例，女性150例，平均年龄61.6±7.0岁。通过问卷访谈收集研究对象的基本资料。凡出现下列情况者予以剔除:伴随脑出血、周围血管疾病、大动脉炎、自身免疫疾病、明显肺部感染、恶性肿瘤、严重肝肾功能不全、严重营养不良。

1.2 研究方法 采集清晨空腹静脉血3～5ml，采用低渗溶血、三氯甲烷法抽提外周白细胞基因组DNA、用多聚酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性测定ABCA1 R219K基因多态性。引物由上海生工生物工程公司合成。上游引物:5’-GTATTTTTGCAAGGCTACCAGTTACATTTGACAA-3’，下游引物:5’-GATTGGCTTCAGGATGTCCATGTTGGAA-3’。10L PCR反应体系含:基因组DNA 0.2～0.5g，上游和下游引物分别为10pmol/L，4 × dNTP 0.25mmol/L，Taq 酶 0.5U，10Taq 酶缓冲液 1L，MgCl22mmol/L。扩增条件:预变性94℃ 4min;反应循环:变性 94℃ 50s、退火 58℃ 50s、延伸 72℃ 1 min，循环32次;最后72℃延伸10min。限制性内切酶消化反应体系20L:PCR产物10L，EcoN1 3U，10 NEBuffer4(含BSA)2L，37℃消化6h。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，以 pUC19DNA/MspI酶解片断作为DNA片断的标准物，于恒压(80V)下电泳2～3h。ABCA1 R219K产物片断总长度为177bp，经特异性限制内切酶消化后，可出现3种片段大小的组合。分别为 RR:177bp;RK:177bp，107bp，70bp;KK:107bp，70bp(见图1)。将RR型和KK型进行DNA序列测定。由测序图谱(见图2)可以看出，ABCA1的PCR扩增产物序列RR型中的碱基C(见图2中箭头所指)突变为KK型中的T(见图2中箭头所指)，即互补链中的G突变为A，相应氨基酸编码由AGG(精氨酸)变为AAG(赖氨酸)。

1.3 血脂测定 采用酶法测定血清TC和TG;用磷钨沉淀法测定HDL-C;LDL-C采用公式计算;圆周免疫法测定ApoA1和ApoB100;ELISA双抗夹心法测定Lp(a)。

1.4 统计分析 应用SPSS10.0软件包进行统计分析。计量资料以χ±s表示，计数资料以百分比表示，先进行正态分布检验，偏态分布数据先行对数转换，两组间比较采用 t检验，2组以上采用One way ANOVA检验，用LSD方法进行两两比较。分类资料采用χ2检验。采用Logistic回归模型评判脑梗死危险因素作用的大小，分别计算各自的比值比(OR)及其95%可信区间(CI)。

图1 ABCA1 R219K PCR产物酶切片断8%聚丙烯酰胺凝胶电泳谱

图2 PCR产物测序图谱

2 结果

2.1 脑梗死组与对照组一般资料比较 见表1。脑梗死组与对照组在性别、年龄、体重指数比较上，差异不显著，无统计学意义(P＞0.05)。在脑梗死常见的危险因素如收缩压、舒张压、高血压病史(率)、糖尿病史(率)、卒中家族史(率)、饮酒史(率)及吸烟史(率)上，脑梗死组比对照组明显增高，差异显著，有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 脑梗死组与对照组生化指标比较 见表2。脑梗死组 BS、TG、TC、LDL-C、CREA 的水平高于与对照组，差异显著，有统计学意义(P＜0.05)，但CREA在正常范围，无临床意义;脑梗死组HDL-C水平显著低于对照组，差异显著，有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 OCSP各型脑梗死组与对照组的血脂比较 见表3。与对照组血脂水平比较，部分前循环梗死组、后循环梗死组及腔隙性梗死组的TG均高于对照组，差异性显著，有统计学意义(P＜0.05);OCSP各型梗死组HDL-C均低于对照组，差异显著，有统计学意义(P＜0.05)。部分前循环梗死组的TG、LDL-C、ApoB高于对照组，ApoA-1低于对照组，差异显著，有统计学意义(P＜0.05);不同OCSP分型脑梗死组血脂间比较，部分前循环梗死组ApoB高于腔隙性梗死组，差异显著，有统计学意义(P＜0.05);其他各项血脂指标组间比较，差异不显著，无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 脑梗死组与对照组ABCA1 R219K基因型的比较 见表4。脑梗死组RR型频率高于对照组，差异不显著，无统计学意义(P＞0.05)，脑梗死组与对照组ABCA1 R219K其余各基因型分布频率比较，差异均不显著，无统计学意义。

2.5 ABCA1 R219K基因型对血脂和脂蛋白水平的影响 见表5。ABCA1 R219K各基因型组间TG、TC、HDL-C、LDL-C、ApoB、ApoA-1、LP(a)水平差异不显著，无统计学意义(P＞0.05)，各基因型组两两比较显示，KK基因型组的 TG、TC、HDL-C和ApoA-1水平均高于RK和RR基因型组，更进一步比较，KK基因型组的TG水平高于RR基因型组，差异显著，有统计学意义(P＜0.05)，KK基因型组的TC、HDL-C、ApoA-1水平均高于RK基因型组，差异显著，有统计学意义(P＜0.05)。

2.6 ABCA1 R219K基因型与脑梗死OCSP分型比较 见表6。脑梗死各OCSP分型(未收集到全前循环梗死病例)的ABCA1 R219K基因型比较，差异不显著，无统计学意义(P＜0.05)。

表1 脑梗死组与对照组一般临床资料比较

表2 脑梗死组与对照组生化指标比较(χ±s)

表3 OCSP各型脑梗死与对照组的血脂比较

表4 脑梗死组与对照组ABCA1 R219K基因型的比较

表5 ABCA1 R219K基因型对血脂和脂蛋白水平的影响

表6 ABCA1 R219K基因型与脑梗死OCSP分型比较

3 讨论

脑梗死发病的基本病理基础是动脉粥样硬化及斑块形成，动脉粥样硬化的重要危险因素是血脂代谢失衡［12］和炎症反应［13，14］。目前公认的脂蛋白滞留-应答学说［15］进一步阐明了脂质异常导致动脉粥样硬化的病理过程，HDL-C被认为是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，其水平的高低反映了机体逆向转运胆固醇的能力。HDL-C水平越高，动脉血管壁等外周组织胆固醇蓄积的可能性越小，血管壁硬化程度越低。研究证实［6］ABCA1促进细胞内游离胆固醇和磷脂(主要是卵磷脂)向贫脂或无脂的HDL-C前体载脂蛋白A1(ApoA1)转移，启动HDL-C的生成，从而在胆固醇代谢，清除组织内过多胆固醇，抗动脉粥样硬化等方面发挥决定性作用。Laloux等［16］的研究结果表明高甘油三酯血症在脑梗死各个亚型中均普遍存在，Tobias等人进行一项大型前瞻性队列研究［17］表明脑梗死组HDL-C水平显著低于对照组，研究发现白种人的ABCA1 R219K基因突变率超过40%，HDL-C水平升高明显，从而减慢动脉粥样硬化的发展［9］。本研究资料表明脑梗死组患者血脂中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的水平高于对照组，对照组HDL-C水平高于脑梗死各OCSP分型组(本研究未收集到完全前循环梗死病例)，差异显著，有统计学意义，其结果与上述研究结果相符，提示血脂异常者罹患脑梗死的风险明显增高。HDL-C可能是脑梗死的保护性因素。

大多数研究［18～20］表明 ABCA1 R219K K 等位基因在降低甘油三酯的水平、升高HDL-C水平和产生有益的临床血脂谱方面起重要作用，从而能减缓动脉粥样硬化的严重程度，RR基因型血清中的有较高的甘油三酯水平和较低的HDL-C水平，Clee等［21］的研究表明K等位基因能降低冠状动脉粥样硬化性心脏病的患病风险，K等位基因可作为动脉粥样硬化的单独保护因素，然而Takagi等［8］的研究结果却不支持以上结论，他们认为R219K与血浆HDL-C水平及动脉粥样硬化的形成无明显相关。我们的研究发现KK型分子个体血脂水平均高于RK型和RR型，其中KK型分子个体的TG高于RR型，KK型分子个体的TC、HDL-C、ApoA-1高于 RK型，差异显著，有统计学意义(P＜0.05)，而其他血脂水平比较各基因型间比较均无显著性差异。

ABCA1 R219K基因多态性与冠心病的相关性研究在国内外不同人种中陆续有报道，但对于ABCA1 R219K与脑梗死关系的研究报导较少。多数研究认为K等位基因能减少冠心病的发病，但有研究［22］却表明R等位基因与冠心病独立相关。有研究报道［23］K等位基因是脑梗死的独立保护因素。然而一项针［24］对英国人群中ABCA1 R219K基因多态性与缺血性卒中的研究表明两者无明显相关。我们研究发现脑梗死组RR型频率高于对照组，但差异无显著意义，脑梗死组与对照组ABCA1 R219K其余各基因型分布频率比较，差异均不显著，无统计学意义，提示ABCA1 R219K基因多态性与脑梗死无显著相关性;根据OCSP分型，通过对脑梗死分层分析后发现，不同OCSP分型脑梗死的R219K基因型比较，差异无显著意义，提示ABCA1 R219K基因多态性与脑梗死不同OCSP分型无显著相关性。以上不同的研究结果可能与ABCA1 R219K的变异因种族、年龄、性别和环境不同而对脑梗死产生不同影响有关。

本实验因未收集到完全前循环梗死病例，分析原因考虑与该型患者较其他各型发病率少，且因病情过于危重采取就地医治有关，本实验并未严格匹配血压、吸烟、饮食等混杂因素，因此有必要对以上混杂因素进行更严格的配比，扩大研究例数在不同人种中进行研究，并对ABCA1基因其它单核苷酸多态性与脑梗死TOAST分型等其他脑梗死分型的关系做进一步研究。

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