4种滋阴药含药血清的免疫调节作用的比较研究*

★赖小东 赵益 尚广彬 徐国良 孙有智（江西中医学院 南昌 330004）

临床上治疗肿瘤的方法虽然各不相同，但滋阴清热是其中最为常用的治疗方法之一。滋阴药可以提高机体的免疫功能来达到抗肿瘤的作用，例如六味地黄汤、山药、墨旱莲、枸杞子能提高免疫功能[1-6]。本实验选择了4种常用的滋阴方：六味地黄丸、二至汤、二冬膏、一贯煎，考察他们对大鼠免疫功能的影响以及分泌IL-2的作用，比较其提高免疫的强弱，为研究抗肿瘤效应提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠，雄性，体重180±20g，由江西中医学院实验动物中心提供。批号：SCXK（赣）2005-0001。

1.2 实验药品

天冬、麦冬、女贞子、墨旱莲、北沙参、麦冬、当归、生地、枸杞子、川楝子，均购于北京同仁堂药店；六味地黄丸水蜜丸（北京同仁堂药店，批号：1004701）。

二冬汤：精密称取天冬200g、麦冬200g，第一次加入8倍量的水煎煮3小时，第二次加入6倍量的水煎煮2小时，合并滤液，过滤，滤液浓缩，密度为2g/mL。

六味地黄丸：称取六味地黄丸300g，加双蒸水研磨至密度为2g/mL。

二至汤：称取女贞子200g、墨旱莲200g，第一次加入8倍量的水煎煮3小时，第二次加入6倍量的水煎煮2小时，合并滤液，过滤，滤液浓缩，密度为2g/mL。

一贯煎：称取北沙参161g，麦冬161g，当归161g，生地483g，枸杞子193.2g，川楝子80.5g。第一次加入8倍量的水煎煮3小时，第二次加入6倍量的水煎煮2小时，合并滤液，过滤，滤液浓缩，密度为2 g/m L。

1.3 主要试剂与仪器

刀豆蛋白A：Sigma公司（批号：20110918）；脂多糖：Sigma公司（批号：20110926）；大鼠白细胞介素IL-2试剂盒：上海西塘生物科技有限公司；

1.4 动物分组与含药血清制备

清洁级SD大鼠30只，普通环境，自然光照，自由饮水、普通饲料，室温20±2℃，适应性饲养三天后，按体重随机分为两组：空白对照组、二冬汤组、六味地黄丸组、二至汤组、一贯煎组，每组6只。根据预实验，确定给药剂量为二冬汤7.99g/kg/天，六味地黄丸4.8g/kg/天，二至汤6.77g/kg/天，一贯煎15.4 g/kg/天，每天分2次以灌胃方式给药，给药5天后，取血，放在25℃室温下静置1小时，凝血后2 000rpm离心20分钟，取上清液，并将同一组大鼠的血清合并，56℃灭活30分钟，然后用0.22μm醋酸纤维素膜过滤，4℃保存备用。

1.5 大鼠脾淋巴细胞的制备

无菌条件下剖开雄性SD大鼠腹腔取脾，用生理盐水冲洗干净，在100目筛网上一边研磨一边用Hank＇s液冲洗，收集分离所得的脾细胞悬液，1 000r/分离心5分钟，吸弃上清；添加红细胞裂解液10mL，混匀脾细胞，静置4-5分钟，待红细胞完全破碎后，1 000r/分离心5分钟，吸弃上清剔除红细胞，Hank＇s液冲洗3遍，用RPMI1640培养液重悬细胞，计数，调整脾细胞浓度为1×108个/mL。

1.6 4种含药血清对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响

在96孔培养板中分别加入含药血清使终浓度为10%，20%，每个浓度组分别设相应浓度的空白对照组血清最为对照组。每组设3个复孔，另外设置一个不含血清组对照，每孔中加入1×108个/mL细胞悬液100μL，100μg/mL的ConA，使终浓度为10 μg/mL，将培养板置5%的CO2培养箱饱和湿度37℃培养72小时。于培养结束前4小时，加入5mg/mL的MTT溶液20μL，置37℃5%CO2培养箱中继续培养4小时。取出培养板，每孔加入200μL二甲基亚砜（DMSO），静置20分钟，使紫色结晶呈完全溶解。，以无细胞悬液孔调零，490nm处使用酶标仪测OD值。

1.7 4种含药血清对LPS诱导的B淋巴细胞活性检测

在96孔培养板每孔中分别加入含药血清使终浓度为10%，20%，每个浓度组分别设相应浓度的空白血清组对照。每组设3个复孔，每孔中加入1×108个/mL细胞悬液100μL，100μg/mL的LPS使终浓度为5μg/mL，将培养板置5%的CO2培养箱饱和湿度37℃培养72小时。于培养结束前4小时，加入5mg/mL的MTT溶液10μL，置37℃5%CO2培养箱中继续培养4小时。取出培养板，每孔加入200μL二甲基亚砜（DMSO），静置20分钟，使紫色结晶呈完全溶解。，以无细胞悬液孔调零，490nm处使用酶标仪检测OD值。

1.8 4种含药血清对ConA/LPS诱导脾淋巴细胞分泌IL-2的影响

用24孔培养板，每孔加入1×108个/mL脾细胞悬液1mL，并加入100μg/mL的ConA/LPS溶液，使终浓度为10/5μg/mL，根据前期研究结果，确定含药血清加入量为10%，空白血清组加入相应的空白血清血清，将培养板置37℃，5%CO2培养箱中，培养48h后，离心，沉淀，取上清液，备用。

1.9 统计学分析

采用SPSS12.0分析软件对数据进行方差分析，结果用（±s）表示，P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 4种含药血清对ConA/LPS诱导的大鼠淋巴细胞增殖的影响

见表1、2。

表1 4种含药血清对ConA诱导的大鼠T淋巴细胞增殖的影响（n=3，-±s）

表1 4种含药血清对ConA诱导的大鼠T淋巴细胞增殖的影响（n=3，-±s）

注：与空白血清组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别空白血清+conA二冬含药血清+conA六味含药血清+conA二至含药血清+conA一贯煎含药血清+conA含药血清浓度10%0.157±0.019 0.258±0.024**0.272±0.041**0.256±0.015**0.217±0.013*20%0.147±0.024 0.286±0.020**0.242±0.045*0.251±0.026**0.210±0.018*

表2 4种含药血清对LPS诱导的B大鼠淋巴细胞增殖的影响（n=3，x-±s）

表1结果表明，二冬汤含药血清对ConA诱导的T淋巴细胞增殖均具有促进作用，与空白对照组比有极显著性差异（P＜0.01），且随给药浓度的增加其增殖效应也增加，20%浓度的含药血清对ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞的增殖作用最强；六味地黄丸10%浓度、20%浓度的含药血清都能增加T淋巴细胞的增殖，与空白对照组比有显著性差异（P＜

0.05 ），其中10%浓度的效果强于20%浓度；二至汤和一贯煎对T淋巴细胞的增殖并未看出随浓度增加效应增大的趋势，二至汤组与空白对照组比较有极显著性差异（P＜0.01），一贯煎组与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。

表2结果表明，二冬汤含药血清对LPS诱导的B淋巴细胞的增殖均具有促进作用，与空白对照组比有极显著性差异（P＜0.01），且随给药浓度的增加其增殖效应也增加，20%含药血清的增殖作用最强；六味地黄丸两个浓度的含药血清都能引起B淋巴细胞增殖，与空白对照组比有显著性差异（P＜0.05）；二至汤两个浓度之间对B淋巴细胞的增殖无明显差异，与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.01）；一贯煎对B淋巴细胞的增殖随浓度增加效应增大的趋势，20%浓度一贯煎组与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。

2.2 4种含药血清对ConA/LPS诱导的大鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响

见表3、4。

表3 4种含药血清对conA诱导的大鼠T淋巴细胞IL-2的影响（n=3，±s）

表3 4种含药血清对conA诱导的大鼠T淋巴细胞IL-2的影响（n=3，±s）

注：与空白血清组比较*P＜0.05，**P＜0.01

IL-2(pg/m L)238.24±10.72 378.24±14.38**361.10±35.72**342.0±22.15**319.19±10.53**组别脾+conA+空白血清脾+conA+二冬血清脾+conA+六味血清脾+conA+二至含药血清脾+conA+一贯煎含药血清

表4 4种含药血清对LPS诱导的大鼠B淋巴细胞IL-2的影响（n=3，±s）

表4 4种含药血清对LPS诱导的大鼠B淋巴细胞IL-2的影响（n=3，±s）

注：与空白血清组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别脾+LPS+空白血清脾+LPS+二冬血清脾+LPS+六味血清脾+LPS+二至血清脾+LPS+一贯煎含药血清IL-2(pg/m L)150.62±6.75 218.24±10.14**168.71±7.95*183.00±5.71**159.19±6.75

表3、4表明，4种滋阴药含药血清可以促进ConA诱导的大鼠脾淋巴细胞分泌白介素-2（IL2），与空白血清组比有极显著性差异（P＜0.01），其中以二冬膏含药血清的作用最为明显。对于LPS诱导的大鼠B淋巴细胞分泌IL-2的作用，二冬含药血清的作用最为明显，与空白血清组比有极显著性差异（P＜0.01）。

3 讨论

中药抗肿瘤的机理有很多种，其中滋阴药抗肿瘤的机制主要集中在：抑制细胞增殖、提高机体免疫力、诱导细胞凋亡等，其中提高机体免疫力是一个重要机制。现代医学认为，机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切关系。当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发生率增高，而在肿瘤进行性生长时肿瘤患者的免疫功能受抑制，二者也互为因果[7]。因此，如何增强机体免疫功能，更好地发挥机体的抗肿瘤免疫机制，已成为目前肿瘤研究的重要课题之一。纵观肿瘤的发生发展过程，肿瘤细胞必须克服内在，细胞自主和外在，免疫介导的屏障才能成瘤，宿主的免疫功能是决定肿瘤发生和发展的最后关卡，只有当癌变细胞通过各种免疫逃避机制逃过免疫监视，克服免疫功能的控制，肿瘤才能进展或致死宿主，因此从这一角度讲，肿瘤可能是一种免疫学。目前中药抗肿瘤有扶正固本法、除痰散结法、化积消滞法、清热解毒法、活血化瘀法、滋阴清热法等，是现代中药抗肿瘤的基本疗法。药物集中在：扶正类，如人参、甘草、黄芪、党参；消积类，如陈皮、莪术、猪苓；还要解毒类，如半枝莲、仙鹤草、夏枯草、白花蛇舌草[8]。目前临床上治疗肿瘤的方法虽然各不相同，但滋阴清热是其中最为常用的治疗方法之一。临床以养阴清热法治疗恶性肿瘤，大都可取得提高生存质量，减轻化疗毒副反应的效果[9-10]。大量地临床实践说明阴虚与癌瘤的发生发展之间存在一定的相互关联性。对此，我们在分析目前肿瘤发病机制认识的基础上，结合现代医学理论，提出了“阴虚癌瘤相关”的新假说，认为滋阴法能改变肿瘤发生的内环境，既可有效预防恶性肿瘤的发生，也能抑制恶性肿瘤的生长[11]。

脾脏拥有全身循环T淋巴细胞的25%，直接参与细胞免疫，并对外周血中T细胞亚群的分布具有重要的调节作用，脾脏对T淋巴细胞免疫的调节作用是肿瘤免疫的一个重要环节，B淋巴细胞约占脾内淋巴细胞总数的55%，在肿瘤抗原刺激下转化为浆细胞，继而分泌特异性抗肿瘤的免疫球蛋白IgG，且具有抗原提呈能力[12]。白介素-2（IL-2）是一种在白细胞或者免疫细胞间相互作用的淋巴细胞因子，与血细胞生长因子同属细胞因子，两者相互协调、相互作用，共同完成造血和免疫调节功能，并在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用，同时可以促使T/B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）分泌抗体及干扰素，并产生抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用[13]。

本从本实验的结果可见，四种滋阴药含药血清都可以促进T、B淋巴细胞的增殖、促进IL-2的分泌，提示滋阴药主要是通过提高肿瘤细胞的免疫功能达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。

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