构建定向T载体用于基因克隆和表达

钟星，翟超，陈亮，余晓岚，蒋思婧，严红，杨登想，马立新

1 湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062

2 湖北省工业生物技术重点实验室，湖北 武汉 430062

3 湖北大学知行学院生物工程系，湖北 武汉 430011

随着越来越多的物种基因组测序工作被完成，基因组数据库收录的基因组信息日益丰富，由已知序列设计引物扩增DNA并克隆，再进行相关结构、功能的研究，加快了生命科学研究的进程[1-2]。聚合酶链反应 (PCR)是最强有力的基因克隆方法，为了直接克隆PCR产物，T载体被广泛使用[3-5]。尤其当面对大量的克隆工作时，使用T载体克隆PCR产物便成为最经济简便的做法。传统的 T载体克隆方法利用 LacZ alpha插入失活筛选插入事件[6]，但是由于 LacZ基因的移码、载体自身发生异常重组等事件将导致产生一部分假阳性白色菌落，转化后的白色菌落仍然需要被大量培养进行质粒抽提和鉴定[7-8]；利用传统的T载体进行克隆表达时，由于插入片段的方向具有随机性，无法保证定向克隆，仍然需要筛选定向插入的克隆。

为了克服传统 T载体克隆方法需要大量鉴定重组子和无法保证定向克隆的缺点，我们设计了一个 LacZ正向筛选方案来实现免鉴定重组子、定向T载体克隆基因的方法。如图1B所示，在非诱导条件下的Lac+的宿主菌中，Lac启动子下游LacO序列被LacO结合蛋白LacI所阻遏，LacZ基因的表达处于抑制状态，该菌落在X-gal底物平板上显示为白色；如果基于pBR322的高拷贝载体上含有 LacO序列，该载体将从 LacZ启动子单元上竞争性吸附宿主菌内源LacI蛋白，对宿主菌的乳糖启动子去抑制[9-10]，表达β-半乳糖苷酶并降解X-gal底物，使该菌落显示为蓝色(图 1C)。pET-23a(+)是基于 pBR322改造的高拷贝载体。我们在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG，利用PCR片段和定向T载体连接重构完整的LacO序列 (图1A)，转化Lac+菌株，使含有正确克隆的菌落变蓝来指示定向插入的重组事件 (图 1C)。对转化后平板上的蓝色菌落接种抽提质粒后酶切和 PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子。本研究利用构建的定向T载体成功地克隆了103个人类肝蛋白编码基因，随机挑选其中 8个基因的克隆进行蛋白质表达，均获得成功表达。对比传统方法，利用该T载体进行基因克隆非常简单、高效、可靠，并且可以实现基因定向插入，实验过程无需鉴定重组子，避免了大量抽提质粒和PCR鉴定的步骤，节约了大量的时间和试剂成本，同时该定向T载体还兼容传统T载体基因克隆，该定向 T载体有大规模高通量的基因克隆和表达的应用前景。

图1 定向T载体克隆原理Fig. 1 Principle of a directional T vector cloning method. After ligation, the insert and vector will reconstituted a full length of ideal LacO(A); reconstituted full length of ideal LacO occurring on a high copy number plasmid pETG will titrate out of the lac repressors (LacI )which adhered to the LacO sites on F` plasmid, thus LacZ transcription is derepressed (B), and the colonies go blue (C). Followed by transformation, the recombinant events were phenotypically selected, transformants with blue color revealed the desired recombinants.

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

表达载体pET-23a(+)、用于表达的大肠杆菌BL21(DE3)购自Novagen公司，用于克隆的大肠杆菌XL10-Gold购自Stratagen公司，DH10β [基因型：mcrAΔ (mrr-hsdRMS-mcrBC)ф80lacZM15 ΔlacX74deoR recA1 araΔ 139 (ara，leu)7697 galU galK λ-rpsL nupG tonA umuc:: pir116 -frt F′ (Lac+pro+ΔoriT::Tc)]为哈佛医学院 Stephen J Elledge教授所赠送[10]，gfp模板质粒pHBM2002为本实验室朱德武博士构建[11]。

1.2 主要仪器和试剂

DNA分子量标准、SolutionⅠ连接试剂盒、LA Taq聚合酶和限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ及StuⅠ购自TaKaRa公司；蛋白质分子量标准和限制性内切酶 BfuⅠ购于 Fermentas公司；质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，引物 (表 1)均在上海桑尼生物科技有限公司合成。所有的分子克隆操作都按照Sambrook等[12]提供的方法进行。

1.3 方法

1.3.1 定点诱变消除pET-23a(+)上的BfuⅠ位点

根据pET-23a(+)载体序列设计两对突变引物Mu23aF和Mu23aR、MublaF和MublaR，将载体上的两个 BfuⅠ酶切位点消除突变为 StuⅠ位点。PCR分别扩增BfuⅠ酶切位点两侧的载体片段，琼脂糖凝胶回收后共转化XL10-Gold感受态细胞，通过体内定点同源重组[11]，获得重组中间载体 pET-23aM，送上海英骏生物公司测序。

1.3.2 构建定向T载体pETG

设计一对引物在5¢端各引入pET-23aM同源臂和一个BfuⅠ位点，下游引物紧邻BfuⅠ位点引入 13 bp的部分 LacO序列。用该引物从pHBM2002上扩增得到Prrn-gfp表达盒片段。载体PET-23aM经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶回收大片段。将回收的载体片段与prrn-gfp表达盒片段共转化大肠杆菌 XL10-Gold感受态细胞，通过体内定点同源重组，获得定向T载体pETG，送上海英骏生物公司测序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.3 BfuⅠ酶切制备T载体

BfuⅠ酶切载体pETG，琼脂糖凝胶回收完全酶切后的大片段，−20 ℃冻存。

1.3.4 PCR扩增目的基因和T载体克隆

根据NCBI数据库核苷酸序列查询，选择感兴趣的基因 (如ATF5)，利用Genetool软件设计一对引物，在所有的下游引物5¢端额外补加7 bp部分 LacO 序列 (5¢-CACAATT-3¢，如表 1 所示)。利用该引物和 LA Taq DNA聚合酶扩增目的基因，并琼脂糖凝胶回收目的片段。用连接酶试剂盒连接～60 ng PCR产物和～20 ng线性化定向T载体，连接反应参见试剂盒说明。连接物转化大肠杆菌DH10β感受态细胞，涂布含有50 mg/mL氨苄西林钠和 25 mg/mL X-gal的 LB平板。在37 ℃培养箱中避光培养10 h后，挑取蓝色转化子抽提质粒。

1.3.5 蛋白质表达和SDS-PAGE检测

测序正确的克隆转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞，蛋白质表达和SDS-PAGE检测方法参见分子克隆手册[12]。

1.3.6 目的蛋白质质谱鉴定

将目的蛋白质条带从SDS-PAGE胶上割下，按文献[13]进行胶内消化与质谱鉴定分析。

2 结果

2.1 定向T载体的构建

以质粒 pET-23a(+)为模板，引物 Mu23aF和Mu23aR、MublaF和MublaR分别扩增获得预期的～2.1 kb和～1.5 kb片段，琼脂糖凝胶回收后共转化大肠杆菌XL10-GOLD感受态细胞，获得重组中间载体 pET-23aM。由于实验设计是将两个BfuⅠ位点消除并诱变成StuⅠ位点，StuⅠ酶切鉴定 pET-23aM 可以切出约 1.5 kb小片段，而pET-23aM经BfuⅠ酶切无法切出小片段，该酶切鉴定结果表明pET-23a(+)上面的BfuⅠ酶切位点被成功诱变消除 (图2)。

以质粒 pHBM2002为模板，引物 GFPF和GFPR扩增获得预期的1 098 bp prrn-gfp表达盒片段，琼脂糖凝胶回收后通过同源重组插入pET-23aM 中 NdeⅠ和 XhoⅠ位点，获得定向 T载体pETG (图3)。pETG经BfuⅠ酶切得到约1 kb和3.6 kb的两个片段 (图4)，该结果表明gfp表达盒已成功插入载体pET-23aM中，两个 BfuⅠ酶切位点均被正确引入。

2.2 制备线性化定向T载体

超纯质粒抽提试剂盒抽提pETG质粒，BfuⅠ完全酶切pETG后，琼脂糖凝胶回收约3.6 kb的T载体片段 (图4)，制备线性化定向T载体完成，该T载体可以用于下游连接反应。

图2 酶切鉴定pET23aMFig. 2 Identification of pET23aM by restriction enzyme digestion. M: DNA marker; 1: pET23aM; 2:pET-23a(+); 3: pET23aM digested with Stu I; 4:pET23aM digested with Bfu I; 5: pET-23a(+)digested with Stu I; 6: pET-23a(+)digested with Bfu I.

图3 pETG载体图谱及部分关键序列Fig. 3 A plasmid map of pETG and key sequences. (A) gfp expression cassette flanked by 6×his tag-Bfu I sites and Bfu I sites-13/20 LacO sequence was inserted into Nde I-Xho I site of pET-23aM. (B) The key sequence of pETG was indicated. (C)Bfu I restriction site and a full length of LacO sequence were showed, N stands for any base.

2.3 连接转化和分析重组率

PCR扩增的基因片段连接线性化定向 T载体，转化大肠杆菌DH10β，从转化平板 (图1)上随机挑取 10个蓝色单菌落, 抽提质粒并进行酶切和PCR鉴定分析重组率。由于T载体末端设计有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，可以利用该酶将插入片段ATF5 (849 bp)切除下来，质粒的酶切鉴定结果显示从随机挑取的 10个蓝色的单菌落抽提出来的质粒都切出目的基因大小的片段，与预期结果相符 (图 5A)，同时利用基因特异性的上游引物和载体通用引物T7ter进行PCR扩增表明，10个质粒都含有目的基因插入，并且均为正向插入，扩增片段大小都和预期结果相符 (图5B)，重组率为100%。

图4 定向T载体pETG琼脂糖凝胶电泳分析Fig. 4 Identification of directional T vector pETG by agarose gel electrophoresis. M: DNA marker; 1:pET23aM (3 666 bp); 2: pETG (4 649 bp); 3: pETG digested with Bfu I.

图5 重组子的酶切 (A) 和PCR (B)鉴定Fig. 5 Identification of recombinants by restriction enzyme digestion and PCR. (A)Identification of recombinants by Nde I-Xho I restriction digestion. M: DNA marker; 1−10: Nde I-Xho I digested plasmids isolated from 10 blue colonies,respectively; 11: PETG digested by Nde I-Xho I. (B)The plasmid DNA from 10 independent blue colonies was amplified by PCR, PCR products were separated on a 1.5% agarose gel and visualized after EB straining. M: DNA marker; 1−10: PCR products of 10 recombinants isolated from 10 blue colonies, respectively; 11: PCR product of vector PETG.

2.4 蛋白质表达和分析

本研究利用定向T载体成功地克隆了103个人类肝蛋白编码基因，从中随机挑选8个基因的克隆 (基因名称和克隆效率见表2)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白质表达后，SDSPAGE分析如图6所示，8个pETG克隆经诱导后在理论大小处均有蛋白条带变粗，表明有目标蛋白质表达 (图6)，重组蛋白质条带割胶后经质谱鉴定证明为对应的目标蛋白质。

3 讨论

在当代分子生物学研究当中，无论研究的是已知基因还是未知基因，往往需要将扩增的目的基因克隆入适当的载体中，以便用于各种分析。T载体克隆 PCR产物虽然已经得到了广泛的应用，但是由于存在假阳性的问题，大量的资源和时间被浪费在后续重组子筛选鉴定中；对于某些基因的特定功能研究还需要进行蛋白质表达，由于基因插入T载体的方向是随机的，反向插入基因无法正常表达，理论上传统T载体克隆方法最高只有50%的几率获得定向插入的重组子，利用传统 T载体进行基因克隆和表达仍然需要耗费大量时间、人力和物力用来抽提质粒、鉴定基因的插入方向[7-8]。如何实现高通量基因克隆和表达，避免繁琐的筛选重组子工作、降低实验研究的工作强度一直是分子生物学研究者所希望的。

表2 已表达的8个基因的克隆效率和理论蛋白分子量Table 2 Clone efficiency and protein theoretical molecular weight of 8 gene

图6 SDS-PAGE分析重组蛋白Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins. M: molecular mass standard protein. Control: BL21(DE3)/pETG.

目前利用传统的 T载体进行基因克隆存在两大问题，一是假阳性问题无法避免，需要大量抽提转化子进行鉴定；二是基因插入方向不能定向，仍然需要大量人工筛选转化子进行插入方向鉴定。传统方法利用GFP[14]，KillerRed[8,15]或者LacZ[6]等基因的表型缺失来淘汰不完全酶切的载体背景，该方法在一定程度上降低了筛选重组子的工作量，但是仍然无法避免线性化T载体异常重组和反向插入基因造成的背景干扰；商品化的Topo®TA克隆试剂盒可以实现基因的定向克隆，重组效率大约在90%，该方法同样存在背景污染的问题，克隆仍然需要大量抽提质粒并鉴定重组子，并且载体只能一次性使用，需要购买昂贵的试剂盒。本研究利用自制的定向 T载体和PCR片段连接重构20 bp LacO序列来一步法表型筛选基因的插入和定向双重事件。当T载体和基因片段发生正确的连接反应时，T载体上的13 bp 部分LacO序列将和PCR片段上的7 bp部分LacO序列重构完整的20 bp LacO序列，重构的LacO序列将竞争性吸附宿主菌中的LacO结合蛋白 (LacI)，对宿主菌的 LacZ基因表达去抑制 (图1)，该单菌落在X-gal底物平板上将变蓝。该方法筛选重组子的方式比传统 T载体使用的LacZ alpha插入失活的遗传筛选方式更为严谨，T载体自环化产生的转化子、反向插入转化子、T载体背景和 LacZ自发移码转化子都不会被筛选到，而仅仅只有目的基因定向插入，且20 bp LacO序列成功重构的重组子可以被筛选到。由于该筛选方案是基于可见的表型获得筛选，不同于传统的表型缺失筛选，该筛选方法保证了克隆筛选的唯一正确性，如图1所示的蓝色转化子抽提质粒进行鉴定后显示定向插入重组效率为100%，所有被抽提的蓝色转化子质粒都含有定向插入的目的基因。

利用该定向T载体进行基因克隆非常简单、高效、可靠，不用购买商业的T载体试剂盒，还可以实现基因的定向插入；实验过程避免了繁琐的筛选鉴定重组子工作；并且该定向T载体还可以实现基因的无缝克隆，表达的蛋白质不会融合额外的非必要氨基酸序列。常规方法利用XcmⅠ、AhdⅠ、EcoR V制备T载体均会在克隆序列附近残留部分酶切位点碱基序列，无法实现无缝克隆，当进行蛋白质表达时，蛋白序列上会附加额外的氨基酸序列，该序列可能会对蛋白质的表达或者功能表征有一定负面影响。本研究利用限制性内切酶BfuⅠ酶切T载体实现了基因的无缝克隆，避免了非必要序列的融合。BfuⅠ属于IIS型限制性内切酶，其切割位点在识别位点之外，并且切割位点为识别位点下游第 5位任意的碱基(图 3C)，通过 PCR扩增 prrn-gfp引入两个背向插入的BfuⅠ位点，其识别位点临近prrn-gfp，当制备线性化的T载体时，该限制性酶切位点被全部切除，不会残留任何酶切位点序列，从而实现了基因的无缝融合，当进行蛋白质表达时不会给蛋白质序列融合额外的氨基酸序列，保证了蛋白质序列的天然忠实性。

本实验成功构建了一种新颖的定向T载体，利用该T载体成功的定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因。随机挑选了其中8个基因的克隆进行蛋白质表达显示8个基因对应的蛋白质均获得成功表达。利用该定向T载体进行基因的克隆和表达非常简单、高效，不仅省去了大量复杂的鉴定重组子工作，实现了基因的定向插入、基因的无缝融合表达，还可以节约大量宝贵的科研时间，降低克隆成本，同时该定向T载体还兼容传统的T载体基因克隆，有高通量大规模基因克隆和表达的应用前景。

[1]Eisenberg D, Marcotte EM, Xenarios I, et al.Protein function in the post-genomic era. Nature,2000, 405(6788): 823−826.

[2]Vukmirovic OG, Tilghman SM. Exploring genome space. Nature, 2000, 405(6788): 820−822.

[3]Cha J, Bishai W, Chandrasegaran S. New vectors for direct cloning of PCR products. Gene, 1993,136(1/2): 369−370.

[4]Jeung JU, Cho SK, Shim KS, et al. Construction of two pGEM-7Zf(+)phagemid T-tail vectors using Ahd I-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products. Plasmid, 2002, 48(2):160−163.

[5]Holton TA, Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res, 1991, 19(5):1156.

[6]Choi YJ, Wang TT, Lee BH. Positive selection vectors. Crit Rev Biotechnol, 2002, 22(3): 225−244.

[7]Ito Y, Suzuki M, Husimi Y. A T-extended vector using a green fluorescent protein as an indicator.Gene, 2000, 245(1): 59−63.

[8]Liu X, Liu X, Zhou Y, et al. T vector bearing KillerRed protein marker for red/white cloning screening. Anal Biochem, 2010, 405(2): 272−274.

[9]Cranenburgh RM, Lewis KS, Hanak JA. Effect of plasmid copy number and lac operator sequence on antibiotic-free plasmid selection by operator-repressor titration in Escherichia coli. J Mol Microbiol Biotechnol, 2004, 7(4): 197−203.

[10]Li MZ, Elledge SJ. MAGIC, an in vivo genetic method for the rapid construction of recombinant DNA molecules. Nat Genet, 2005, 37(3): 311−319.

[11]Zhu D, Zhong X, Tan R, et al. High-throughput cloning of human liver complete open reading frames using homologous recombination in Escherichia coli. Anal Biochem, 2010, 397(2):162−167.

[12]Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold spring Harbor Laboratory Press, 2002.

[13]Chen X, Zhai C, Kang L, et al. High-level expression and characterization of a highly thermostable chitosanase from Aspergillus fumigatus in Pichia pastoris. Biotechnol Lett, 2012,34(4): 689−694.

[14]Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science, 1994, 263(5148): 802−805.

[15]Liu X, Shi R, Zou D, et al. Positive selection vector using the KillerRed gene. Anal Biochem, 2011 412(1): 120−122.