结肠癌组织 AQP1与 MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达的关系及意义

石晓明 吴胜春 唐雷 杨永宾 吕柏楠

研究证实，水通道蛋白1(AQP1)在宫颈癌、结直肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤中均存在高表达［1－4］，对肿瘤细胞的侵袭、黏附、转移等多种生物学行为都具有调节作用，已成为恶性肿瘤生物治疗的潜在靶点。但迄今关于AQP1的具体作用机制尚未完全阐明，有关AQP1在结肠癌组织中表达及意义的研究笔者也不多见。因此，本研究检测 AQP1、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)在结肠癌及癌旁组织中的表达，对结肠癌组织中这些蛋白质之间的关系进行分析，对AQP1在结肠癌中的作用和意义进行了初步探讨。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选择2007年9月至2010年10月在我院普外科就诊患者54例，其中男40例，女14例;年龄38～74岁，中位年龄58岁。所有患者均手术并有术后确诊病理。取原发癌石蜡标本，并取其中40例的癌旁组织标本。

1．2 免疫组化染色(SP 法)检测 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表达 兔抗人 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1多克隆抗体均为美国Santa Cruz公司产品，免疫组化试剂盒为迈新生物技术公司产品。均采用SP法分别对肿瘤组织和癌旁组织进行各指标的免疫组化染色。石蜡标本连续4 μm切片，脱蜡水化后3%过氧化氢孵育，蒸馏水冲净后以磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡进行抗原修复。严格按免疫组化试剂盒要求进行操作:工作液封闭、加入一抗、孵育并冲洗后依次加二抗工作液、辣根酶标记链酶卵白素工作液。DAB显色，苏木素复染后进行脱水，最后中性树脂封片，分别进行HE和免疫组化染色。

1．3 免疫组化结果判断标准 由两位病理学医师双盲阅片判断免疫组化结果。每张石蜡切片在镜下随机取5个400倍视野，每视野计数 100 个细胞，AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1 以细胞浆呈黄色为染色阳性，按肿瘤细胞着色强度和阳性细胞率分别进行记分。按着色强度记分:无着色记0分，淡黄色记1分，黄色记2分，棕黄色记3分。按肿瘤细胞阳性细胞率记分:阳性细胞≤5%(0分)，6% ～25%(1分)，26% ～50%(2分)，51% ～75%(3分)，≥76%为(4分)。两种记分结果相乘为0～1记为阴性(－)，2～3记为弱阳性(+)，4～7阳性(++)，≥8强阳性(+++)。

1．4 统计学分析 应用SAS 8．0统计软件，等级资料比较采用秩和检验，相关关系采用Spearman等级相关分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 结肠癌和癌旁组织中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表达强度 45例结肠癌组织中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1阳性表达率分别为 75．93%、64．81%、77．78%、46．30%;癌旁组织中这4种蛋白质表达阳性率分别为22．50%、37．50%、50．00%、70．00%。经比较，AQP1、MMP-2、MMP-9 在结肠癌组织中的表达均较癌旁组织增强，而TIMP-1在癌旁组织中表达高于癌组织(P ＜0．05)。见表1。

表1 结肠癌和癌旁组织AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达情况 例

2．2 结肠癌和癌旁组织中 AQP1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表达的关系 AQP1与MMP-2、AQP1与MMP-9间表达强度量正相关(r值分别为 0．4030 和 0．3874，P ＜0．01)，MMP-2 与TIMP-1、MMP-9与 TIMP-1之间表达呈负相关(r值分别为－0．3176和 －0．4728，P ＜0．05)。

3 讨论

近年来结肠癌的发生率在我国明显上升，作为一种全身性疾病严重威胁群众的健康。由于该病起病比较隐匿、多无明显特异性症状，患者就诊时经常已处于晚期，治疗效果不佳，预后差。而有关影响结肠癌侵袭转移的基因目前还不完全明确。因此，寻找影响结肠癌进展的基因对于确定新的肿瘤标志物、分析结肠癌发生进展机制、寻找肿瘤基因治疗靶标有重要意义。AQP1即为目前受到关注的基因之一，AQP1为水通道蛋白家族的成员之一，基因定位于染色体7p14，蛋白质分子量为28 kD，以四聚体形式存在于细胞膜上。AQP1的主要功能为转运水分子，还可转运甘油及其他小分子物质［5］。国内外均有研究发现AQP1在宫颈癌、结直肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤中均存在高表达，可促进肿瘤新生血管的形成，导致肿瘤的侵袭、转移［1－4］。体外实验表明，抑制其表达可有效逆转肿瘤细胞的侵袭转移能力［4，6］。说明AQP1与肿瘤侵袭转移关系密切。本研究显示，AQP1在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0．01)，说明AQP1与结肠癌关系密切，对其功能进行分析可为结肠癌发生进展机制研究提供依据。

AQP1的调控机制目前还不完全清楚。但有研究表明AQP1可以通过影响p38MAPK通路的活性而使膀胱癌细胞的侵袭迁移活性发生改变［7］。目前关于AQP1与结肠癌侵袭转移能力关系的研究尚不多见，故本研究对AQP1和反应肿瘤细胞侵袭黏附能力的 MMP-2、MMP-9、TIMP-1之间的关系进行了分析。MMPs可以降解细胞外环境中的蛋白质、破坏肿瘤细胞侵袭的体内屏障，导致肿瘤细胞侵袭转移至其他部位［8］。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成员，可直接促进结肠癌的侵袭转移［9］。TIMP1则是 MMP-2、MMP-9的抑制物，可以抑制肿瘤的侵袭转移［10］。本研究发现AQP1与MMP-2、AQP1与MMP-9表达呈正相关，提示AQP1可能通过促进MMP-2、MMP-9表达而导致结肠癌细胞侵袭、黏附能力增强。但本研究并未发现AQP1与TIMP-1之间有关。我们推测这可能是在结肠癌细胞中AQP1只能调控部分侵袭相关因子，且AQP1、TIMP-1对肿瘤细胞所起的调控作用位于侵袭黏附过程的不同水平，所以关系并不明显。

本研究证实了AQP1在结肠癌组织中表达增高，AQP1可能通过影响MMP-2、MMP-9的表达而促进结肠癌细胞侵袭转移。但我们也发现结肠癌细胞中影响肿瘤细胞侵袭功能的基因网络化调节极其复杂，有关AQP1的具体功能尚待进一步深入研究。

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9 Zhang XX，Fu Z，Zhang Z，et al．Microcystin-LR Promotes Melanoma Cell Invasion and Enhances Matrix Metalloproteinase-2/-9 Expression Mediated by NF-κB Activation．Environ Sci Technol，2012，46:11319-11326．

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