5－氯甲基水杨醛缩苯丙氨酸过渡金属(Ⅱ)配合物的合成及抗菌活性

熊亚红，梁 毅，陈祖强，陈洁霞，黄剑锋，周建平，钱业龙

(1 华南农业大学理学院，广东广州 510642;2 华南农业大学生物材料研究所，广东广州 510642）

Schiff碱是指含有亚胺基—RC==N—并通常是由伯胺与活泼羰基化合物所形成的一类化合物，这类化合物是因H.Schiff于1864年首次发现而得名［1］.至今，人们在研究Schiff碱及其配合物时选用最多的活泼羰基化合物是水杨醛.通过在水杨醛的苯环上添加各种取代基使得水杨醛Schiff碱及其配合物具有各种优良的性质［2］.当形成Schiff碱的伯胺为氨基酸时，这类Schiff碱称为氨基酸Schiff碱.氨基酸Schiff碱由于具有多个氧和氮原子，且其分子含有活泼的氨基酸基团，易于与金属离子配位，是一类重要的生物配体.氨基酸Schiff碱与金属形成的配合物具有多种化学和生物活性，如:氨基酸Schiff碱配合物具有催化氨基转移和外消旋作用，可作为研究维生素B6酶反应的优良模型［3］;它们还具有抗菌、消炎、抗癌活性，可用于药物研究［4］;此外，氨基酸Schiff碱配合物还可以用来抑制超氧离子自由基［5］等.目前，关于氨基酸Schiff碱配合物的研究非常活跃.

L － 苯丙氨酸(L－Phenylalanine，L－Phe)是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人体和动物不能靠自身自然合成的必需氨基酸之一，而且L－Phe可作为抗癌药物的载体将药物分子直接导入癌瘤区，从而有效抑制癌瘤生长和降低药物的毒副作用［6］.已有大量文献报道了L－Phe与水杨醛或水杨醛衍生物得到相应Schiff碱及其各种金属配合物的合成方法及其抗菌等生物活性［4］.笔者曾对一种取代水杨醛——5－氯甲基水杨醛(5－(Chloromethyl)salicylaldehyde，Cmsa)的合成方法进行了改进［7］，至今鲜见关于Cmsa的氨基酸Schiff碱及其配合物的报道.本文通过Cmsa与L－Phe缩合得到一个新的Schiff碱，并以此为配体合成了 5 个过渡金属(Mn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+)Schiff碱配合物，采用元素分析、摩尔电导、光谱法及差热－热重等方法对这些化合物的组成、结构进行了表征，并探索其荧光性能，采用滤纸片法和试管二倍稀释法研究了它们对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性.本研究工作有助于拓宽抗菌药物的研究范围，为探索和开发高效低毒的抗菌药物奠定一定的理论和试验基础.

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

大肠埃希菌Escherichia coli(G－)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(G+)均由华南农业大学农学院－广东省植物分子育种重点实验室提供并自行保藏.平板培养基为w=5%的MH琼脂，液体培养基为w=2.5%的MH肉汤粉.

1.2 仪器与试剂

Vario EL元素分析仪(德国 ELEMENTAR公司)，AA－6300C型火焰原子吸收光谱仪(上海圣科仪器设备有限公司)，DTG－60型差热热重分析仪(日本Shimadzu 公司)，AVATAR 360 FT－IR 光谱仪(美国Nicolet公司)，UV－2550紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)，RF－5301PC 荧光分光光度计(日本Shimadzu公司).

Cmsa为自行制备，根据文献［7］提出的改进方法合成，熔点为85～86℃.L－苯丙氨酸、MH琼脂、MH肉汤粉均为国产生化试剂，其他试剂均为国产分析纯试剂.

1.3 5－氯甲基水杨醛缩苯丙氨酸的合成

参照文献［8－9］，将10 mmol Cmsa和10 mmol LPhe(含10 mmol KOH)分别溶于热的体积分数为95%乙醇中，搅拌下将前者滴加入后者，50℃条件下反应30 min，沉淀经过滤、重结晶、洗涤、真空干燥后，得2.51 g黄色固体粉末，产率为70.5%.

1.4 配合物的合成

参照文献［8－9］，将含 1 mmol金属盐［Mn(Ac)2、Co(Ac)2·2H2O、NiCl2·6H2O、Cu(Ac)2·H2O、Zn(Ac)2·2H2O］的体积分数为95%乙醇溶液逐滴加入等摩尔的上述配体溶液中，50℃条件下搅拌反应30 min，沉淀经过滤、洗涤、真空干燥，产率为60% ～70%.

1.5 配合物抗菌活性的测定

参照文献［10］，采用滤纸片法测定配体及其配合物的抑菌圈大小.将Schiff碱配体及其配合物配制成1.0 mg·mL－1的二甲基亚砜(DMSO)溶液，每片滤纸直径为6.0 mm，载药量为20 μL，同一平板上每种化合物平行做2片，37℃条件下培养20 h后观察结果，测定抑菌圈的大小，同时以溶剂和金属盐作对照试验.试验结果为3次平行试验的平均值，相对平均偏差均在5%以内.

参照文献［10－11］，采用试管二倍稀释法测定最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC).将上述配体和配合物溶液分别用DMSO稀释至原浓度的 1/2n(n=0、1、2、3、4、5)后，依次移取 50 μL 加入已接种的小试管中，于37℃、相对湿度＞80%条件下培养24 h后观察现象，采用比浊法确定MIC值，同时以溶剂和金属盐作对照试验，平行试验3次.

2 结果与分析

2.1 配体与配合物的组成及一般性质

采用Vario EL元素分析仪测定了Schiff碱配体及其配合物的C、H、N元素含量，采用AA－6300C型火焰原子吸收光谱仪测定了配合物中过渡金属元素含量，元素分析结果列于表1.从表1得出:配体为一种含有1分子结晶水的钾盐KHL·H2O(L=C17H14O3NCl2－)，5种配合物中配体和金属离子的配位比均为1∶1，且配合物分子中含有1～4个H2O.室温下，以DMSO为溶剂测得配体的摩尔电导率(Λm)为68.3 S·cm2·mol－1，配合物的 Λm为 10.5 ～24.3 S·cm2·mol－1，表明在该溶剂中配体属于1∶1 型电解质，配合物均不电离，为非电解质［12］，结合配合物的化学组成，推测配体是以负二价离子与金属离子配位生成中性配合物.测得Schiff碱配体的熔点为189～191℃，配合物均无确定的熔点.

溶解性试验表明:配合物易溶于DMSO，微溶于N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、氯仿、硝基苯，难溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚.故采用DMSO作为溶剂来配制配合物的溶液.

表1 Schiff碱配体及其配合物的元素分析和摩尔电导率Tab.1 Elemental analysis and molar conductance date for the ligand and complexes

为了进一步证明化合物中所含H2O的类型，对配体和配合物进行了热重－差热分析(TG－DTA)，试验结果列于表2.由表2可以看出，由脱水产生的失重率的试验值与理论值吻合得很好;在90～110℃间，只有Schiff碱配体、钴配合物及镍配合物出现吸热峰，该吸收峰可归结为失去结晶水而产生的;而在170～200℃间，所有配合物均出现一个明显的脱水吸热峰，这是脱去配位水而产生的.通过计算，不难得出Schiff碱配体组成中含1分子结晶水，锰配合物和钴配合物中各含1分子结晶水和1分子配位水，镍配合物含3分子结晶水和1分子配位水，铜配合物和锌配合物中各含1分子配位水.

2.2 FT-IR光谱分析

比较配体和其配合物的红外谱图，通过特征峰的位移和新特征峰的产生可判断配体是否与金属配位及推测可能的配位点.本文采用KBr压片法在AVATAR 360 FT－IR光谱仪上测定了配体及其配合物的红外光谱，部分数据见表3.

表2 Schiff碱配体及其配合物的热重分析数据Tab.2 Data of TG-DTA analysis of the ligand and complexes

表3 Schiff碱配体及其配合物的主要IR特征吸收频率Tab.3 Major IR spectral data of the liganf and complexes cm－1

试验测得Cmsa的红外光谱中，在1659 cm－1处有一个归属于醛基—CHO的强伸缩振动峰，当Cmsa与苯丙氨酸(Phe)缩合形成Schiff碱配体后，配体中醛基峰消失，从表3可以看出，在1620 cm－1处出现一个归属于亚胺基的v(C==N)振动峰尖锐的强吸收峰，说明了Schiff碱配体的形成.在3350～3450 cm－1范围内的宽吸收峰表明配体和配合物中存在水分子.配合物与配体相比，υ(C==N)峰和υas(COO－)峰均发生明显蓝移，υs(COO－)和υ(Ar—O)峰均明显红移，表明亚氨基氮、酚基氧及羧基氧均与中心金属离子(Mn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+)配位，而且配合物中Δυ［υas(COO－) － υs(COO－)］值均大于200 cm－1，表明配体中的羧基为单齿配位方式［13］，455～473 cm－1范围内的υ(M—N)弱吸收峰的出现，进一步证明配合物的形成.

结合红外分析结果和表2中TG－DTA分析结果可知，这些配合物中金属离子均为四配位，Schiff碱配体为负二价的三齿配体，通过亚氨基氮、酚基氧及羧基氧参与配位，第4个配位位置由1分子水占据.

2.3 UV光谱分析

以DMSO作为溶剂，在UV－2550紫外可见分光光度计上测定了配体与配合物的紫外可见光谱，并将其B带和R带的λmax列于表4.B带是苯环本身的π→π*吸收带，R带是C==N键的N原子p轨道的孤对电子与苯环大π键发生p－π共轭而产生的n→π*吸收带［14］.从表4中的数据可以看出，配合物与配体相比，B带发生了10～26 nm的红移，R带发生了30～65 nm的明显红移，进一步证明亚胺基氮参与了配位.这2个主要吸收带的红移是由于形成配合物后，氮上的孤对电子与中心离子形成配位键，分子中的稠环数目增多，π键共轭程度增大，能量降低，导致π→π*和n→π*跃迁能量降低.已有文献报道在其他一些Schiff碱配合物中也存在类似的规律性［10，14－15］.

表4 Schiff碱配体及其配合物的紫外光谱和荧光光谱数据Tab.4 Ultraviolet and fluorescence spectra data of the ligand and complexes

由元素分析、摩尔电导率、TG－DTA、IR及UV的测定与分析，推测配体及配合物的可能结构如下:

其中，M=Mn2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+;n分别为1，1，3，0，0.

2.4 荧光光谱

Schiff碱配体中C==N键上的N原子直接与中心金属离子配位，因此以R带的λmax作为激发波长更能反映出配合物与配体荧光性质的差异.本文以DMSO为溶剂，R带的λmax作为各自的最佳激发波长，采用RF－5301PC荧光分光光度计测定了配体和配合物的荧光发射光谱.从表4列出的最大发射波长λem和相对荧光强度可以看出，配合物的λem均较相应Schiff碱配体的发生明显红移(12～27 nm)，进一步说明有配合物生成;另外，配合物的荧光强度较Schiff碱配体有不同程度的增强，这是由于过渡金属离子参与配位增加了配体的π电子共轭程度，且结构刚性增强的结果［16］.比较表4中5个配合物的相对荧光强度，发现配合物ZnL(H2O)的相对荧光强度最大，约为Schiff碱配体的14.7倍，虽然该增幅与黎植昌等［17］报道的5种Schiff碱单核锌配合物的数值(43.5～227.0倍)相比要低得多，但远高于丁瑜等［18］报道的一种Schiff碱三核锌配合物的数值(约1.3倍)，可将这一性质用于Zn2+的荧光分析.显然这种荧光增强的程度与Schiff碱的组成及配合物的构型有密切关系.

2.5 配体与配合物的抗菌活性

采用滤纸片法测得配体及配合物在质量浓度1.0 mg·mL－1下对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径(表5).结果表明，在试验浓度下，对于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌而言，配合物均较配体具有更强的抗菌作用，相应的金属盐在1.0 mg·mL－1质量浓度下几乎无抗菌作用，表明形成配合物后，过渡金属离子与Schiff碱配体的协同作用增强了抗菌能力.配合物抗菌能力的提高可能是由于金属离子配位后，配合物较Schiff碱配体的共轭效应增强，脂溶性增强，更容易透过生物膜到达靶部位，因而抗菌能力增强，也可能是中心金属离子增强了药物与受体之间的电子迁移能力所致［19－20］.比较这5个配合物的抑菌圈大小，很容易看出配合物CuL(H2O)的抗菌活性最高，由图1也可直观地看出该配合物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果，这与文献报道的Schiff碱铜配合物具有良好的抗菌活性的结果一致［19－20］.抑菌圈直径小于10 mm表示弱抑菌效果，在10～20 mm为中等抑菌，大于20 mm为强抑菌［10］，根据这一判断标准，本文中抗菌能力最强的配合物CuL(H2O)属于具有中等抑菌能力的药物.单从抑菌圈直径大小来看，配合物CuL(H2O)的抑菌圈直径与Chohan等［20］报道的5种水杨醛氨基酸Schiff碱铜配合物的相当.据文献报道，配合物越稳定，其抗菌活性越小［8］，推测这些Schiff碱配合物之间抗菌能力的差异可能与配合物的稳定性有关.表5中的数据表明，Schiff碱配体及其配合物对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌的抗菌能力略高于对革兰阴性菌大肠埃希菌，尤其是配合物CuL(H2O)，但它们对这2种细菌的抗菌活性差异不大，表明这些配合物的抗菌性能具有一定的广谱性.不同的是，毕思玮等［8］发现由水杨醛与L－Phe缩合得到的N－亚水杨基苯丙氨酸Schiff碱对这2种细菌均无作用，且其铜(Ⅱ)配合物只对大肠埃希菌有较强的抗菌活性.可见在水杨醛的苯环上添加不同取代基可以有效改变水杨醛Schiff碱及其配合物的一些生物活性，这也进一步说明研究不同水杨醛Schiff碱及其配合物是很有价值和意义的.

表5 Schiff碱配体及其配合物的抑菌圈Tab.5 The bacteriostasis circle diameters of the ligand and complexes

图1 CuL(H2O)对大肠埃希菌(A)和金黄色葡萄球菌(B)的抑菌圈Fig.1 Bacteriostasis circles of CuL(H2O)against Escherichia coli(A)and Staphylococcus aureus(B)

尽管滤纸片法得到的抑菌圈大小能够直观地反映药物的抗菌能力，但抑菌圈直径受到药物浓度、药物扩散速率、操作熟练度等诸多因素的影响，抑菌圈的直径的绝对大小可能不能真正反映药物的抗菌能力大小，导致不同文献中抑菌圈直径具体数值的可比性不强.而测定MIC的控程度更高，该值就是可完全抑制菌体繁殖时的最低药物浓度，不同文献中的MIC的可比性更高.因此，本文在上述滤纸片法的基础上进一步采用二倍稀释法测定了配体及配合物的MIC，结果列于表6.表6中的数据表明，在试验用的这几种Schiff碱配合物中，配合物CuL(H2O)对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC均最小，而且其对金黄色葡萄球菌的MIC低于对大肠埃希菌的MIC，这与上述滤纸片法的试验结果一致.由于受溶解度的限制，部分配合物未能准确得到 MIC.Lv等［21］报道了一种抗菌活性几乎可与商品化抗生素氯霉素相媲美的Schiff碱铜配合物，该配合物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为32和2 μg·mL－1，表6中配合物 CuL(H2O)的相应 MIC 值与其比较接近，表明该配合物的抗菌活性较高.

表6 Schiff碱配体及其配合物的MICTab.6 The MIC of ligand and complexes

3 讨论与结论

本文合成的新的Schiff碱配体及其过渡金属配合物的组成和结构与文献报道的类似Schiff碱及其配合物的结构［8－9］相似.通过荧光试验验证了不少文献报道的Schiff碱形成配合物后荧光发射强度增强的结论，本文通过比较一系列过渡金属Schiff碱配合物的荧光发射强度，发现其锌配合物的荧光发射强度增幅最大(14.7倍)，这种增幅与其他Schiff碱锌配合物［17－18］相比属于中等水平，这将为 Schiff碱作为分析试剂用于过渡金属元素(尤其是Zn2+)的荧光分析检测提供基础数据，有助于拓宽氨基酸Schiff碱的应用面.文中合成的这些配合物的抗菌活性均强于Schiff碱配体，且铜配合物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均表现出最强的抗菌活性.与众多水杨醛Schiff碱金属配合物的抗菌活性［10，19－21］相比，该铜配合物的抗菌活性属于较高的，但离常见药用抗生素［20－21］的抗菌活性还有一定的差距，有待进一步从Schiff碱配体的组成、金属离子种类及配合物的结构上进一步优化，以获得抗菌活性更高的氨基酸Schiff碱过渡金属配合物.该研究结果将为后续设计和筛选高效低毒、抗菌谱广的抗菌药物提供一定的科学研究基础及理论依据.

Chohan等［20］认为部分金属的Schiff碱配合物与其Schiff碱配体相比，抗菌活性没有明显提高的原因可能是配合物本身的脂溶性不高，本课题组曾报道了一些铜的氨基酸配合物具有较高的超氧化物歧化酶(SOD)活性［22］，对 DNA 具有断裂作用［11］，Lv 等［21］发现铜表面被活化的氧对细菌具有抑制作用，本文一系列过渡金属配合物中，恰好是铜Schiff碱配合物的抗菌活性最高，初步推测其抗菌活性还可能与配合物的一些催化活性有关.因此在这类氨基酸Schiff碱过渡金属配合物的抗菌机理上有待进一步深入研究.

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