杀虫双对杜氏盐藻生长和生理生化的影响

蔡 马，姜建国，贺立红，余土元

(1 仲恺农业工程学院生命科学学院，广东广州 510225;2 华南理工大学轻工与食品工程学院，广东广州 510640）

杀虫双(2－二甲胺基－1，3－双硫代磺酸钠基丙烷)是一种应用于水稻和其他农作物的有机氮杀虫剂，与沙蚕毒素有类似结构，在中国作为六六六(Benzene hexachloride，BHC)的替代物［1］.由于水生生物能够在体内积累杀虫剂等化学物质，杀虫剂的使用会对水生生物包括藻类和它的生物化学系统造成危害［2］.因此，寻找检测和监测水生环境中农业化学污染物的有效方法是十分有意义的.藻类是初级生产者的重要组成部分，对藻类的有害作用可能会影响整个食物链［3］.杜氏盐藻Dunaliella salina是杜氏藻属中的一种极度耐盐的单细胞绿藻.杜氏盐藻具有一些特殊的性质使之能够在极端环境中生存，例如可以耐受 0.05 mol· L－1至饱和(5.5 mol· L－1)NaCl、强光照、高温和 pH 1～11的广泛酸碱环境［4］.杜氏盐藻的另一种特性是它在极端的渗透胁迫下能够在细胞内过度积累β胡萝卜素以维持胞内的渗透平衡，是一种最优良的β胡萝卜素的生物来源［5］.杜氏盐藻的这些性质使其在环境毒理学的研究领域作为受试生物具有显著的应用价值.本论文通过检测农业杀虫剂杀虫双对杜氏盐藻细胞生长、单细胞β胡萝卜素质量和抗氧化酶SOD及CAT活性的剂量作用，以及杀虫双对杜氏盐藻的毒性作用，阐明该杀虫剂的环境作用.希望能够为杀虫剂的使用和环境控制提供有用的参考.

1 材料与方法

1.1 盐藻培养

杜氏盐藻藻种(FACHB-435)购自中国科学院野生生物种质库－淡水藻种库.杜氏盐藻细胞培养在含1.5 mol· L－1NaCl的培养液中.培养条件为温度26 ℃，光照强度8000 lx，光/暗周期为14 h/10 h，摇床转速 96 r·min－1.

1.2 毒性试验

杜氏盐藻培养至对数期或对数后期收集藻细胞，重悬于50 mL新鲜培养液中，同时，分别加入不同浓度的杀虫双继续培养.设置杀虫双质量浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 和 5.0 mg·L－1.以不加杀虫剂的藻液作为对照.培养条件同1.1所述.使用光学显微镜观察细胞形态.

绘制细胞数(Y，×104)与D630nm(X)之间的关系曲线，由回归方程(1)计算样品的细胞数.

每24 h取样，以相同盐度的新鲜培养液作为空白调零，分别测量各个样品的光密度(D630nm).

1.3 β胡萝卜素质量浓度检测

使用分光光度计测量D453nm，并绘制β胡萝卜素/丙酮标准溶液与D453nm之间的标准曲线，得回归方程(2):

其中，y为 β胡萝卜素质量浓度(mg·L－1)，x为D453 nm.

吸取2 mL 藻液 8000 r·min－1离心 10 min，收集藻体并溶解于2 mL丙酮中，不断震荡直至所有色素都被提取出来.使用60 g·mL－1的乙醇－KOH溶液0.2 mL 4℃下皂化色素提取混合液3 h.加入w为1.2%NaCl溶液后用乙醚萃取β胡萝卜素，干燥后溶解于2 mL丙酮中，测量其D453nm值，最后根据标准曲线计算β胡萝卜素质量浓度，随后根据藻液细胞数计算出单细胞的β胡萝卜素质量.

1.4 粗酶液的提取

加入杀虫剂培养2 d后的藻液在室温下8000 r·min－1离心10 min，去除培养液收集藻体.准确称取0.5 g新鲜藻体移至2 mL离心管中，加入1 mL PBS(50 mmol·L－1，pH 7.8)和 0.02 g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP).4 ℃ 条件下 12000 r·min－1离心20 min，以破碎植物细胞.随后4℃条件下12000 r·min－1离心30 min，上清液即为粗酶提取液.粗酶提取液直接用于酶活检测或按体积比1∶1加入50 g·mL－1甘油溶液，－20℃条件保存备用.

1.5 SOD活性测定

参照王学奎［6］方法并略作修改进行SOD活性测定.反应混合液包含 1 mL甲硫氨酸(Met，39 mmol·L－1)、1mL 硝 基 蓝 四 氮 唑 (NBT，189 μmol·L－1)、15 μL 粗酶提取液和 1 mL 核黄素(6 μmol·L－1).反应液置于 4000 lx 日光下反应20 min后，使用分光光度计测定光密度(D560nm).以1 mL Met、1 mL NBT和1 mL PBS混合液作为空白样.1 mL Met、1 mL NBT、15 μL PBS 和 1 mL 核黄素混合液作为对照样.1 mL Met、1 mL NBT、15 μL 粗酶提取液和1 mL PBS混合液作为色素值样.一个SOD酶活性单位(U)定义为将NBT的还原性抑制到对照一半(50%)时所需的酶量.由下式计算SOD活性(U·g－1):

其中，DCK为对照样的光密度，DS为样品的光密度，DP为色素值样的光密度，V为粗酶提取液总体积(mL)，Vt为样品反应液中粗酶液体积(mL)，mf为样品鲜质量(g).

1.6 CAT 活性测定

参照王学奎［6］方法并略作修改进行CAT活性的测定.在25℃ 下测定CAT活性，反应混合液包含1 mL粗酶提取液和 2 mL H2O2(1 mmol·L－1).1 mL粗酶提取液和2 mL PBS(50 mmol·L－1，pH 7.8)混合液为空白样.使用紫外分光光度计在240 nm测定光密度，准确反应5 min后，再测一次光密度.一个CAT酶活性单位(U)定义为每分钟D240nm减少0.1的酶量.由下式计算 CAT 活性(U·g－1·min－1):

其中，ΔD240nm为光密度的减少量，V为粗酶提取液总体积(mL)，Vt为样品反应液中粗酶液体积(mL)，mf为样品鲜质量(g)，t为反应时间(min).

1.7 数据分析

所有试验均设3个重复，并对试验结果取平均值，使用软件 SPSS－13对数据进行统计分析，在95%或99%的置信界限确定显著性.

2 结果与分析

2.1 杜氏盐藻细胞生长

图1显示，使用0.5 mg·L－1杀虫双处理的杜氏盐藻的细胞生长情况与未加杀虫剂的对照样的生长情况相类似，只是细胞数相对显著下降.分别使用1.0、2.0和4.0 mg·L－1杀虫双处理盐藻，在前5或6 d内细胞数呈现下降趋势，但在8 d后细胞数开始增长.另外，使用5.0 mg·L－1杀虫双处理盐藻导致细胞死亡，10 d后细胞几乎死亡殆尽.通过单因素方差分析，各浓度处理样品之间细胞生长显示出显著差异(P＜0.05)，而相关性分析结果表明，盐藻细胞生长显著负相关于杀虫双浓度(r=－0.871＜0，P＜0.05)，杀虫双对杜氏盐藻的10 d IC50为32 mg·L－1.

图1 不同质量浓度杀虫双处理时杜氏盐藻的细胞生长情况Fig.1 Cell growth of Dunaliella salina treated by dimehypo at various mass concentrations

2.2 细胞形态变化

由于杜氏盐藻缺乏细胞壁，光学显微镜观察证实盐藻细胞膜外仅包被着一层糖蛋白膜，长期与污染物接触可能会破坏细胞的完整性.正常藻细胞呈现鲜绿色，健康的细胞会不断游动，而杀虫剂处理的细胞颜色变灰暗变模糊(图2).污染的细胞呈现三角形、圆形或不规则的形状，一些细胞发生破碎，所有这些都说明了杀虫剂对盐藻细胞的破坏作用.从图1和图2可以看出少量的杀虫剂对杜氏盐藻的生长造成的不利影响很小.随着杀虫剂浓度的增大，细胞数逐渐减少，并且破碎细胞的数目也不断增加直到观察不到活细胞.

图2 不同质量浓度杀虫双处理时杜氏盐藻的细胞形态变化情况Fig.2 Cell shape variations of Dunaliella salina treated by dimehypo at various mass concentrations

2.3 β胡萝卜素含量变化

使用上述浓度的杀虫双处理盐藻，在第2天所有样品的单细胞β胡萝卜素含量都会降低(图3).第3 ～6 天，使用 0.5、1.0、2.0 和 4.0 mg·L－1杀虫双处理的样品内单细胞β胡萝卜素含量显著积累，并且与对照样的积累趋势类似，第3～5天各样品中单细胞β胡萝卜素含量始终低于对照样，而第6天时使用0.5、1和2 mg·L－1杀虫双处理的样品内单细胞β胡萝卜素含量反而高于对照样.前4种浓度杀虫双处理样品中单细胞β胡萝卜素含量在第7天再次降低并在第8天重新增长，除1 mg·L－1杀虫双处理的样品在最后两天高于对照样外，其余样品始终低于对照样.使用5 mg·L－1杀虫双处理的样品内β胡萝卜素含量显著降低，最终已检测不到(图3).通过单因素方差分析，大部分处理时间内各浓度处理样品细胞β胡萝卜素的积累显示出显著差异(P＜0.05)，而相关性分析结果表明，单细胞β胡萝卜素含量显著负相关于杀虫双浓度(r=－0.883＜0，P ＜0.05).

图3 不同质量浓度杀虫双处理时杜氏盐藻单细胞β胡萝卜素质量变化情况Fig.3 Single cell β-carotene content variation of Dunaliella salina treated by dimehypo at various mass concentrations

2.4 SOD 活性

在所有杀虫双处理的样品中，杀虫双的处理都会造成杜氏盐藻SOD活性的降低.相关性分析表明SOD活性与杀虫双处理浓度没有显著性关系(P＞0.05).并且单因素方差分析表明杀虫双处理的样品与对照样的SOD活性在生物学上同样没有显著差异(P＞0.05)(表1).

2.5 CAT 活性

除最高质量浓度5.0 mg·L－1杀虫双处理的样品外，其他所有杀虫双处理的样品中均检测到CAT活性的显著提高(表1)，但相关性分析结果显示，在所有处理样品中，CAT活性与杀虫剂处理浓度没有显著性关系(P＞0.05).浓度较低时，杀虫双质量浓度的提高，会刺激CAT活性提高，并在1.0 mg·L－1杀虫双处理时达到最大值.随后，杀虫双质量浓度的进一步提高反而抑制CAT活性，但仍然高于对照(表1).试验结果表明，相对低质量浓度的杀虫双会促进杜氏盐藻细胞CAT活性的显著提高，而过高的杀虫双质量浓度(如5.0 mg·L－1)对CAT活性的提高又有抑制作用.

表1 不同质量浓度杀虫双处理杜氏盐藻2 d后SOD和CAT活性变化情况1)Tab.1 The SOD activity and CAT actiuity of Dunaliella salina after 2 d treated by dimehypo at various mass concentrations

3 讨论

污染物能够引起杜氏盐藻细胞内大量活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)，包括·O2－、1O2和H2O2的积累和膜脂质的过氧化.为了缓解和修复ROS造成的损害，杜氏藻通过积累抗氧化剂包括低分子量的非酶自由基清除剂(如β胡萝卜素)和抗氧化酶如SOD、CAT与过氧化物酶(Peroxidase，POD)保护非饱和的膜脂质、核酸、酶和其他分子结构免受氧自由基的毒害［7］.本文中，在相对低质量浓度杀虫双(0.5～2.0 mg·L－1)处理的杜氏盐藻中，单细胞β胡萝卜素质量在一定时期内(第6天)会高于对照样，同时在杀虫双处理的杜氏盐藻中检测出高水平的CAT活性.使用不同浓度杀虫双进行处理，虽然都会造成SOD活性的降低，但细胞始终保持相对较高的SOD活性水平.所有这些结果都表明，抗氧化剂(β胡萝卜素、SOD和CAT)的存在可能是杜氏盐藻细胞能够在杀虫剂存在的环境下生存和生长的重要因素.根据Streb等［8］的研究，一种高山植物Homogyne alpina由于一种稳定的CAT的存在能够耐受光胁迫.另一项研究表明，高强度的UV－B辐射(13.2 kJ·m－2·d－1)使杜氏盐藻SOD活性显著降低(P＜0.05)，而 CAT 活性只有轻微的变化(P ＞0.05)［9］.陈传红等［10］研究了丁草胺对杜氏盐藻生理生化的影响，发现在较低浓度时对盐藻的类胡萝卜素含量有一定促进作用，浓度加大，类胡萝卜素含量逐渐降低.另外，不同浓度的丁草胺对杜氏盐藻SOD活性具有明显的影响，低浓度时SOD的活性有所增加，随着浓度的加大活性降低，并且过氧化物酶(POD)活性的变化情况与SOD类似.本研究中，SOD活性随着杀虫双浓度的提高不断降低，CAT活性在低浓度杀虫双处理下升高，随后在高浓度处理下降低，但在杀虫双处理的所有样品中CAT活性都高于对照样.说明杀虫双处理时均会刺激杜氏盐藻内CAT活性不同程度的提高，但可能会抑制SOD活性，并且高浓度的杀虫双加剧了这种抑制作用，使SOD活性降低.我们在研究农业杀虫剂敌百虫对杜氏盐藻毒性作用的试验中发现，敌百虫对杜氏盐藻细胞生长、β胡萝卜素含量和抗氧化酶活性的影响与本次试验结果相类似［11］.由此可以推测，杜氏盐藻对农业杀虫剂等毒性物质的一种响应机制可能是通过对细胞内抗氧化剂的调控来应对毒性物质及由其产生的ROS的毒害，且在其他胁迫条件下(如UV辐射)，也可能存在类似的响应机制.

另外，在一些藻类中存在“两阶段效应”(Biphasic effects)，即低水平的有机污染物先抑制后刺激藻类生长.本论文中，在特定质量浓度(0.5～4.0 mg·L－1)的杀虫双处理杜氏盐藻时也发现了类似的结果，显示出对杜氏盐藻的“两阶段效应”.β胡萝卜素水平的恢复可能是细胞生长在抑制作用下得以恢复的原因.Shariati等［12］的研究表明，镉离子浓度的提高显著降低了2个品种(Iranian和Australian)杜氏盐藻的细胞数和叶绿素含量，并且培养液中高浓度镉离子导致氧自由基的形成可能造成了生长速率的降低.与对照样相比，在2个品种的细胞中都检测到单细胞β胡萝卜素含量的提高，这些β胡萝卜素可能也在杜氏盐藻中作为一种非酶的抗氧化机制起重要作用.与“两阶段的效应”不同，陈传红等［10］的研究发现，低浓度的丁草胺对杜氏盐藻生长速率有促进作用，而高浓度的丁草胺对杜氏盐藻生长速率有显著的抑制作用.这种现象被称为“毒物兴奋效应”(Hormesis)，即非常低浓度的有机污染物会刺激藻类生长.

总之，当杀虫双质量浓度小于0.5 mg·L－1时，杜氏盐藻的毒性响应与对照样类似.当使用1.0～4.0 mg·L－1杀虫双处理盐藻时，处理初期细胞生长和单细胞β胡萝卜素水平均降低，接着在几天后恢复.当杀虫双质量浓度大于5.0 mg·L－1，细胞生长和单细胞β胡萝卜素水平都会一直降低，直至检测不到.杀虫双对杜氏盐藻的10 d IC50为32 mg·L－1，小于敌百虫对杜氏盐藻的10 d IC50(179 mg ·L－1)［11］，因而杀虫双对杜氏盐藻的毒性更强，说明杜氏盐藻对不同的农业杀虫剂的耐受效果不同，有助于对不同毒物的毒性进行比较.杀虫剂浓度的提高会抑制盐藻生长，但也能够刺激CAT的活性.以后研究工作的重点将会集中在有机污染物对杜氏盐藻中其他酶(如POD)的毒性作用和多种污染物对杜氏盐藻的联合效应方面.

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