4株新城疫病毒F蛋白和HN蛋白的计算机模建与表面抗原分析

胡思科，席瑞珍，任 涛，廖 明

(1 华南农业大学兽医学院，广东广州 510642;2 河南理工大学资源环境学院，河南焦作 454000）

新城疫(Newcastle disease，ND)又称为亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起鸡/鸽或其他禽类的一种高度接触性传染病，发病率和死亡率均很高，是危害我国养禽业生产的最严重疾病之一［1－2］.自1926年发现 NDV以来，NDV已确定9个I类和10个II类病毒基因型.全球范围内不断出现的NDV新型毒株及现有NDV低毒株或高毒株中基因组序列的变化表明，该病毒在不断进化［3］.Hu等［4］对山东省种鸭养殖场分离到的NDV进行相似性分析，结果表明这些分离株在核酸水平上与I系在f基因可变区有1.9% ～9.9%的变异，与 II系则有 38.5% ～41.2%的变异.Choi等［5］和Lee等［6］对韩国的活禽市场健康鸡和鸭进行NDV毒株监测，系统发育分析显示这些活禽体内分离的NDV属于多种不同的基因型.

目前，防治ND的主要方法仍为接种弱毒疫苗，其中以LaSota和Clone30等弱毒疫苗最为常用，但由于NDV毒株众多，毒力差别较大，给ND的防控带来极大困难［7－8］.研究结果表明，构成 NDV 囊膜表面的大小纤突为F蛋白和HN蛋白，2种蛋白在机体免疫应答和致病过程中发挥着极其重要的作用.HN蛋白在病毒侵染过程中起识别受体的作用，而F蛋白则参与病毒与宿主细胞及宿主细胞间融合过程，2种蛋白均为 NDV 的保护性抗原［9－10］.因此，对 F 蛋白和HN蛋白进行抗原变异研究，对了解和把握NDV的变异规律具有重要意义.本研究在对分离自广东省的2株NDV野毒GM株(强毒株)和JM株(弱毒株)以及NDV疫苗毒株LaSota和标准强毒株F48E9的f和hn基因进行克隆与序列测定的基础上［11］，进一步采用计算机同源模建的方法对这4个NDV毒株的F蛋白(氨基酸残基33～105位和171～454位)与HN蛋白C端的空间结构进行模建.通过计算机图形学及分子模拟手段，计算4个NDV毒株的F蛋白与HN蛋白的单体的表面蛋白溶剂可及表面积(Solvent－accessible surface area，ASA)，并根据ASA预测F蛋白与HN蛋白的表面抗原位置的分布和各毒株之间抗原差异性.

1 材料与方法

1.1 NDV的F蛋白和HN蛋白的编码基因序列和推导氨基酸序列

GM株、JM株、LaSota株及 F48E9株F蛋白和HN蛋白的编码基因序列和推导氨基酸序列，参见席瑞珍［11］.

1.2 ND毒株F蛋白的三维结构模建

采用InsightII软件包(Version 2000)的MODELER程序进行同源模建.所有计算工作均使用了BIOSYM/MSI分子模拟系统.所用的计算机是SGI Indigo2 IMPACT10000图形工作站.

为了准确地模建 GM株、JM株、LaSota株及F48E9株F蛋白的空间结构，笔者选取了蛋白质结构数据库中NDV F蛋白(PDB编号为1G5G，分辨率为3.30 Å)作为模建的模板.这个结构由73个氨基酸和284个氨基酸残基的2个片段组成，它们分别对应F蛋白的F2肽段(33～105位氨基酸)和F1肽段，各毒株相同肽段氨基酸序列相似性分别达到94%和97%.

1.3 ND毒株HN蛋白C端空间结构的模建

利用MODELER程序和同源模建技术，模建GM株、JM株、LaSota株及F48E9株HN蛋白C端氨基酸残基的空间结构.选取蛋白质结构数据库中NDV HN蛋白C端 (片段为头部区域，残基为124～577位氨基酸，PDB编号为1USX，分辨率为2.70 Å)为参考蛋白，参考蛋白与待模建的GM株、JM株、LaSota株及F48E9株HN蛋白的氨基酸序列高度保守，相似性达到96%，可保证模建HN结构的精确性.

1.4 F蛋白和HN蛋白空间结构比较以及蛋白单体的ASA分析

对GM株、JM株、LaSota株及F48E9株F蛋白和HN蛋白进行叠加计算α碳原子和主链原子的均平方根偏差(RMS)，以探求其空间结构的差异，同时通过计算4个NDV毒株F蛋白和HN蛋白的单体ASA来预测表面抗原位置的分布.

2 结果

2.1 F蛋白与HN蛋白三维结构特征

图1、图 2分别为 GM 株、JM 株、LaSota株及F48E9株F蛋白模建空间结构.从立体空间构象来看，F蛋白的空间结构大致分为2部分，头部和茎部.头部结构主要由一些折叠股组成，茎部主要由一长一短2段螺旋结构组成.4个毒株的HN蛋白C端空间构象相同，主要由多个折叠股和4段螺旋结构组成(圆柱状代表螺旋，条带状代表折叠股)(图3).

2.2 F蛋白和HN蛋白空间结构比较

对这4个毒株F蛋白的空间结构进行叠和比较分析后可发现，其分子空间结构变化不大.相对而言，头部是整个F蛋白中分子结构变化最大的部分(图4).

对这4个毒株HN蛋白的空间三级结构进行叠和比较分析后可发现，其分子空间结构几乎完全重叠，呈现高度保守的特点(图5).

图1 GM株与F48E9株F蛋白分子三维空间结构的模建Fig.1 Model of three－dimensional structure of F protein monomer from GM strain and F48E9 strain

图2 JM株与LaSota株F蛋白分子三维空间结构的模建Fig.2 Model of three－dimensional structure of F protein monomer from JM strain and LaSota strain

图3 HN蛋白分子三维空间结构的模建Fig.3 Model of three－dimensional structure of NDV HN protein monomer

图4 GM株、JM株、LaSota株及F48E9株F蛋白分子三维空间结构的叠和Fig.4 Superimpose model of three－dimensional structure of F protein monomer from GM strain，F48E9 strain，JM strain and LaSota strain

图5 GM株、JM株、LaSota株及F48E9株HN蛋白分子三维空间结构的叠和Fig.5 Superimpose model of three－dimensional structure of HN protein monomer from GM strain，F48E9 strain，JM strain and LaSota strain

2.3 F蛋白分子表面抗原位点的空间结构比较

ASA综合分析表明，F蛋白具有5个线性B细胞表位肽段，分别为P1:68～75位氨基酸;P2:100～105位氨基酸;P3:171～183位氨基酸;P4:375～380位氨基酸;P5:438～454位氨基酸.其中 P1、P2位于F2亚单位，P3、P4位于Fl亚单位，P5则位于Fl亚单位七肽重复序列HR2区含有的一段跨膜区上.

F蛋白主要功能区的抗原位点及十几个半胱氨酸位点高度保守.除了5个线性B细胞表位肽，GM株、JM株、LaSota株及F48E9株4个NDV毒株的F蛋白上至少还有8个抗原决定簇位点(72、74、75、78、79、171、343 和 388)，这些位点是比较保守的.第72位和第343位2个位点分别位于F蛋白的主要抗原决定簇区域，即F2亚单位主要疏水区和Fl亚单位C末端富含半胱氨酸区，这2个位点围绕形成融合诱导区，参与膜融合过程，其中任何一个位点的改变都将引起F蛋白空间结构的变化，并对F蛋白的功能产生直接影响.

研究结果表明，4株NDV的F蛋白33～105位氨基酸片段中，72和84～89位之间的氨基酸序列高度保守，其中第72位的氨基酸残基对F蛋白抗原决定簇的空间折叠有重要作用.而F1蛋白处于头部的氨基酸片段变异较大，这也是引起F1抗原差异的主要原因.

通过抗原表位的分布以及对蛋白抗原表位残基的溶剂可及表面的溶剂可及面积和可及分数进行比较分析发现，GM株和F48E9株、JM株和LaSota株、GM株和LaSota株存在差异较大氨基酸残基分别有36、20和39个(表1～表3).

2.4 HN蛋白分子表面抗原位点的空间结构比较

对HN蛋白分子表面抗原位点研究后发现，HN蛋白表面抗原位点主要集中在 263、287、321、332、333、345、347、350、353、472、479、478、513、514、521、569、401～443区域.

对GM株和F48E9株HN蛋白的ASA和可及分数进行比较发现，它们之间只有4个氨基酸残基差异较大，分别为256位(GLY/GLU)，266位 (ALA/ILE)，293 位(LYS/GLY)，495 位(GLU/LYS)(表4).

对JM株与LaSota株HN蛋白的ASA和可及分数进行比较发现，它们之间只有4个氨基酸残基差异较大，分别为218位(ARG/GLY)，269位(SER/ARG)，293 位(GLU/GLY)，495 位(LYS/VAL)(表5).

表1 F48E9株与GM株F蛋白的溶剂可及表面积(ASA)差异显著的残基Tab.1 Notable difference residues of ASA and fraction of F protein between F48E9 and GM strain

表2 JM株与LaSota株F蛋白的溶剂可及表面积(ASA)差异显著的残基Tab.2 Notable difference residues of ASA and fraction of F protein between JM and LaSota str ain

表3 GM株与LaSota株F蛋白的溶剂可及表面积(ASA)差异显著的残基Tab.3 Notable difference residues of ASA and fraction of F protein between GM and LaSota str ain

表4 F48E9株与GM株HN蛋白的溶剂可及表面积(ASA)差异显著的残基Tab.4 Notable difference residues of ASA and fraction of HN protein between F48E9 and GM strain

表5 JM株与LaSota株HN蛋白的溶剂可及表面积(ASA)差异显著的残基Tab.5 Notable difference residues of ASA and fraction of HN protein between JM and LaSota strain

3 讨论

疏水相互作用在维系蛋白质聚集体结构稳定方面占有重要的地位.蛋白质与蛋白质间的疏水相互作用通常与接触表面的非极性基团的分布密切相关.抗原－抗体复合物的形成总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部.通过考察蛋白与蛋白质接触界面的非极性基团的平均分布以及用半经验方法计算抗原－抗体之间疏水自由能可定量地评估疏水相互作用对抗原－抗体复合物形成过程的贡献.

ASA的计算采用了Lee等［12］对分子表面的定义，其分子探针半径为1.4 nm.本文采用计算机同源模建的方法先后模建了GM株、JM株、LaSota株及F48E9株等4个NDV毒株的F蛋白(残基33～105位氨基酸和残基171～454位氨基酸)和HN蛋白C端空间结构，并利用已有的试验数据，结合模建的结构进行了结构功能的分析，通过计算机图形学及分子模拟手段，计算4个NDV毒株的F蛋白与HN蛋白的单体的ASA，并根据ASA预测F蛋白与HN蛋白的表面抗原位置的分布以及各毒株之间F蛋白和HN蛋白的抗原差异性.

通过蛋白三级结构分析可以看出.传统疫苗毒株LaSota与NDV野毒株GM和JM株在F蛋白的表面抗原上存在着较大的差别，标准强毒株F48E9与NDV野毒株GM和JM株在F蛋白的表面抗原上也存在着较大的差别，这有可能导致各毒株的抗原性和毒力等生物学特性发生改变.

我国现在普遍使用的NDV疫苗毒株包括I系(Maktesuar)、IHYUUUI系(BI)和 IV 系(LaSota)，它们与目前国内流行的基因VII型毒株在基因序列特征方面有明显的差异.从本研究结果也可以看出，疫苗毒LaSota株与GM、JM等分离株的三级结构有明显差异.因为抗原决定簇位点氨基酸残基的改变有可能导致抗原性发生改变，所以使用常规疫苗未必能完全保护不同基因型新城疫病毒的攻击，但这需要更多的动物试验数据来证明.

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