热烫前处理对青菜中酶活性及色泽的影响

刘 倩， 张 慜*， 容小红， 赵科金

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122；2.海通食品集团股份有限公司，浙江 慈溪 315300）

青菜属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是以叶片为产品的普通白菜的一个变种，原产中国。青菜可以保持血管弹性，提供人体所需矿物质、维生素，其中的维生素B2尤为丰富，有抑制溃疡的作用，经常食用对皮肤和眼睛的保养有很好的效果。富含纤维，可以有效改善便秘。

存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）在适宜的条件下能引起果蔬的酶促褐变，因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。PPO是一种对温度比较敏感的酶类，在高温条件下很容易失活。果蔬中的过氧化物酶（peroxidase）往往具有较高的热稳定性，对果蔬进行热烫处理时，常以过氧化物酶是否失活作为热烫是否充分的标准。较高的POD和PPO活性会导致酚类化合物的降解，从而引起酶促褐变[1]。热处理的主要目的是杀死微生物和破坏酶的活性，防止水煮叶菜类产品在保藏过程中变色、变味和营养成分的损失，从而提高产品的保质期。果蔬热烫之后，如果其过氧化物酶完全（或95%以上）被破坏，那么就可以认为存在于果蔬中的其它酶都已失活。各种蔬菜获得最佳品质其残留酶活性不超过10%，大多在5%左右[2-3]。许多研究表明果蔬中的过氧化物酶有热稳定和热不稳定两部分。这两部分的比例取决于果蔬的品种和热烫处理的温度。

因此，作者以青菜为原料，研究了不同烫漂处理后青菜中过氧化物酶和多酚氧化酶的活性，叶绿素的含量以及色泽，确定了青菜热烫前处理的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

新鲜上海青：购于江苏无锡市石塘街市场。

愈创木酚（0.05 mol/L）、邻苯二酚（0.1 mol/L）、磷酸缓冲溶液、H2O2（体积分数2%）：均为分析纯试剂。

1.2 仪器设备

FA1104型电子天平：上海天平仪器厂产品；CR-400色差计：日本 Onica Minolta公司产品；HHS型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂产品；UV2600紫外分光光度计：上海天美科学仪器有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 青菜中过氧化物酶热稳定性的探究 愈创木酚法[4-5]。

1）过氧化物酶的提取 称取0.5 g新鲜青菜的叶子于研钵中，加入2 mL磷酸缓冲溶液（0.05 mol/L）研成匀浆后，转入离心管中，再加3 mL磷酸缓冲溶液（0.05 mol/L）冲洗研钵，转入离心管中，等重后于8 000 r/min离心10 min，所得上清液即为粗酶液[6]。

2）最适波长的确定 取适量酶液0.4 mL至于已编号的离心管中，于室温下静置。向离心管中加入2.9 mL磷酸缓冲液 （0.05 mol/L），1.0 mL愈创木酚溶液（0.05 mol/L），最后加入体积分数2%的H2O2溶液1 mL，混匀后立即计时，1 min后在400～500 nm范围内进行波长扫描，测定过氧化物酶催化反应所产生有色物质的最适波长。

3）过氧化物酶活性的热处理 取适量酶液0.4 mL分别置于已编号的离心管中，将试管在60℃水浴中保温1 min后，分别移至85、90、95℃水浴锅中，处理2、3、4 min，然后立即将试管转移至冰浴中，快速冷却至0℃[7]。

4）过氧化物酶活性的测定 向盛有酶液且经过不同热处理的离心管以及室温下静置的离心管中加入2.9 mL磷酸缓冲液 （0.05 mol/L），1.0 mL愈创木酚溶液（0.05 mol/L），最后加入体积分数2%的H2O2溶液1 mL，混匀后立即计时，于最适波长下测定反应混合物吸光值随时间的变化，每隔30 s读数一次，读10次。参比采用加热煮沸5 min后的酶液。重复3次，取平均值。

1.3.2 青菜中多酚氧化酶的研究 邻苯二酚法[4-5]。

1）青菜中多酚氧化酶的提取 分别称取新鲜的和变黄的的叶子0.5 g，加入3 mL磷酸缓冲液（pH 6.94），冰浴研磨匀浆，转移到离心管，再用 3 mL磷酸缓冲液（pH 6.94）冲洗研钵，合并提取液。4℃冷冻离心（6 000 r/min）12 min，上清液即为粗酶液[8]。

2）新鲜青菜中多酚氧化酶活性的测定 在试管中，加入2.0 mL磷酸缓冲液（pH 6.94），5.0 mL儿茶酚（邻苯二酚）以及1 mL新鲜青菜中提取的粗酶液，空白采用1 mL加热煮沸5 min的新鲜青菜叶子中的酶液，煮沸结束后于4℃冷冻离心 （6 000 r/min）12 min 后，冰浴待用[9-10]。

A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，30 s后立刻于410 nm下测定反应体系的A值，每隔30 s记录一次，共记录10次。

3）贮藏过程中不同程度腐败的的青菜中多酚氧化酶活性的测定 在试管中，加入2.0 mL磷酸缓冲液（pH 6.94），5.0 mL儿茶酚（邻苯二酚）以及 1 mL从略腐败以及腐败较严重的青菜中提取的粗酶液，空白分别采用1 mL加热煮沸5 min的略腐败以及腐败较严重的青菜中提取的粗酶液，煮沸结束后于4℃冷冻离心（6 000 r/min）12 min，冰浴待用。

A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，30 s后立刻于410 nm下测定反应体系的A值，每隔30 s记录一次，共记录10次。

4）是否转移到冰浴条件下冷却对新鲜青菜中多酚氧化酶活性影响的测定 在两只试管中，加入2.0 mL 磷酸缓冲液（pH 6.94），5.0 mL儿茶酚（邻苯二酚）以及分别加入1 mL由95℃2 min处理后迅速转移到冰浴条件下冷却与未冷却的新鲜青菜中提取的多酚氧化酶的粗酶液，空白采用1 mL加热煮沸5 min的新鲜青菜中提取的粗酶液 ，煮沸结束后用4℃冷冻离心（6 000 r/min）12 min，冰浴待用。

A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，30 s后立刻于410 nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录10次。

1.3.3 试验指标与测定

1）酶活的测定 过氧化物酶酶活的计算公式以每分钟A470nm变化0.01为1个过氧化物酶活单位（U）。

式中：ΔA470nm为反应时间内OD变化值；VT为提取酶液总体积（mL）；m 为植物鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vs为测定时取用酶液体积（mL）。

多酚氧化酶活性的计算公式以每分钟A410nm值增加0.001定义为一个酶活力单位。

式中：ΔA410nm为反应时间内OD变化值；VT为提取酶液总体积（mL）；m 为植物鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vs为测定时取用酶液体积（mL）。

以未经热处理的酶液的酶活力作为1，计算经不同热处理后酶液中的相对残余活力。

2）色差测定 样品研碎后用色差计测定亨特尔L*值，a*值b*值，标准白板调零，以湿片的色值为基准。

L*值表示亮度，L*越大亮度越大；b*值表示有色物质的黄蓝偏向，正值越大越偏向黄色，而负值越大则越偏向蓝色；a*值表示有色物质的红绿偏向，正值越大越偏向红色，而负值越大则越偏向绿色。

C*即色度又叫饱和度，它是样品灰暗/鲜艳比例的一个指标（从0到60），可按照下面的公式进行计算。

3）叶绿素含量的测定 参照《植物生理生化实验原理和指导》，略有改动[4-5]。

2 结果与分析

2.1 过氧化物酶催化反应产物最适波长的测定结果

由图1可确定过氧化物酶催化反应所产生有色物质A的最适波长为470 nm，在此处吸光值A达到最大值0.503。

图1 过氧化物酶催化反应产物最适波长Fig.1 Optimalwavelength ofperoxidase catalyzed reaction product

2.2 新鲜青菜中过氧化物酶的活性

新鲜青菜中过氧化物酶的活性见表1。由表1可知，未经热处理青菜中过氧化物酶的活性为460.23/（g·min），是比较高的。 实验过程中过氧化物酶催化的反应体系的茶褐色随时间的增加在不断加深。这说明过氧化物酶在不断地催化H2O2将愈创木酚氧化为茶褐色的4-邻甲氧基苯酚[7]。

表1 新鲜青菜中过氧化物酶的活性Table 1 Peroxidase activity of fresh Brassicachinensis L.

2.3 不同条件热处理后青菜中过氧化物酶的活性及对残余活力

由表2可以看出，POD酶较难完全失活。100℃下需热烫5 min才能完全失活，但热烫时间过长会严重破坏绿叶蔬菜的组织细胞，导致营养物质和色素损失较多，从而影响产品质量。为了进一步选择比较好的热烫条件，所以选择了不同的热烫条件研究POD酶的活性情况。

表2 热烫条件与POD酶活的关系Table 2 Blanching conditions with the relationship of POD activity

以未经热处理酶液的酶活力作为1，计算经不同热处理后酶液中的相对残余活力，所得结果如图2所示。

图2 不同热处理后过氧化物酶的相对残余活力Fig.2 Relative residual activity of peroxidase after different conditions of blanching

各种蔬菜获得最佳品质其残留酶活性不超过10%，大多在5%左右，通常以过氧化物酶（POD）的活性大小（蔬菜中最耐热的酶）来作为蔬菜热烫是否充分的指标。

由表3和图2可知，当选择90℃4 min、95℃2 min、95℃ 3 min以及95℃ 4 min的热处理条件时，相对残余酶活力是低于10%的。

2.4 多酚氧化酶活性的测定

新鲜青菜中与不同程度腐败的青菜中多酚氧化酶活性的测定结果见图3。

表3 经过不同条件热处理后青菜中过氧化物酶的活性Table 3 Peroxidase activity of Brassicachinensis L.after different conditions of blanching

图3 新鲜与不同程度腐败的青菜中多酚氧化酶的活性Fig.3 Polyphenol oxidase activity of fresh and different corruption degrees of Brassicachinensis L.

由图3的结果可知，青菜中多酚氧化酶的活性随着腐败程度的增加有递增的趋势，这说明青菜在贮藏过程中的腐败与多酚氧化酶存在一定的关系，通过抑制多酚氧化酶的活性，可以在一定程度上抑制青菜的腐败现象。

2.5 冰浴条件下冷却对新鲜青菜中多酚氧化酶活性的影响

由表4和图4可知，新鲜青菜经过95℃2 min的热烫处理后，青菜中多酚氧化酶的活性大大降低。而且95℃2 min处理后未转移到冰浴条件下冷却与迅速转移到冰浴条件中冷却的新鲜青菜中多酚氧化酶的活性相比，95℃2 min处理后迅速转移到冰浴条件中冷却的新鲜青菜中多酚氧化酶的活性更低， 为2.31 U/（g·min）， 相对残余活力已降至1.24%。而95℃2 min处理后未转移到冰浴条件下冷却的新鲜青菜中多酚氧化酶活性为30.77 U/（g·min），相对残余活力为16.49%。

这是由于热处理后未转移到冰浴条件下冷却的青菜中多酚氧化酶在室温条件下发生了再生，而热处理后迅速转移到冰浴条件，可以使温度迅速下降到0℃。当温度接近0℃时酶的再生受到抑制，这可以更好地降低多酚氧化酶的活性[8]。

表4 经过不同条件处理后青菜中多酚氧化酶的活性Table 4 Polyphenol oxidase activity of Brassicachinensis L.after different treatment

图4 不同处理后新鲜青菜中多酚氧化酶的相对残余活力Fig.4 Relative residual activity of polyphenol oxidase after different treatment

图5 不同热处理后青菜中叶绿素的质量分数Fig.5 Chlorophyll content of Brassicachinensis L.after different blanching

表5 95℃2 min处理后青菜的色泽指标Table 5 Green color indicators of Brassicachinensis L.after blanching for 2 min at 95℃

以未经热处理的酶液的酶活力作为1，计算经不同热处理后酶液中PPO的相对残余活力。

2.6 不同热处理对青菜色泽的影响

2.6.1 不同热处理后青菜中叶绿素的含量 由图5可知，经过不同热处理，青菜中叶绿素的质量分数略有差别。当热处理条件为90℃3 min和95℃2 min时叶绿素质量分数最多，分别为2.33 mg/g、2.31 mg/g。

2.6.2 95℃2 min处理后青菜的色泽指标 在95℃下漂烫2 min后，青菜的色泽指标如表5所示。

由表5和图5可以看出，青菜采用95℃2 min的漂烫处理时，叶绿素质量分数较高，为2.31 mg/g。色泽较好，-a*值为22.84，饱和度C*达到了35.56。

综合以上过氧化物酶及多酚氧化酶活性测定的结果可得出，当青菜95℃2 min烫漂后迅速转移到冰浴条件下冷却，过氧化物酶 （相对残余活力8.53%）和多酚氧化酶（相对残余活力1.24%）的活性均得到了很好的抑制，相对残余活力低于10%，而且在此烫漂条件下青菜的叶绿素质量分数（2.31 mg/g）较高，色泽 （-a*值为22.84，饱和度C*为35.56）也比较好。

这样不仅可以减少热烫对青菜各项指标的损失及组织的破坏，又可消除酶促褐变的隐患。

3 结语

较高的POD和PPO活性会导致酚类化合物的降解，从而引起酶促褐变[12]。热烫前处理的主要目的是杀死微生物和破坏酶的活性，防止水煮叶菜类产品在保藏过程中变色、变味和营养成分的损失，从而提高产品的保质期[13-14]。

综合以上测定的结果得出，当青菜经过95℃2 min烫漂后迅速转移到冰浴条件下冷却，过氧化物酶（相对残余活力8.53%）和多酚氧化酶（相对残余活力1.24%）的活性均得到了很好的抑制，相对残余活力低于10%，而且在此烫漂条件下青菜的叶绿素含量（2.31 mg/g）较高，色泽（-a* 值为 22.84，饱和度C*为35.56）也比较好。因此确定，青菜热烫前处理最佳的条件为95℃烫漂2 min后迅速转移到冰浴条件下冷却。

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