离子交换法纯化α-酮戊二酸

占宏德 ， 李江华 *1，， 刘 龙 ， 堵国成 ， 陈 坚

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，又 α-KG）作为三羧酸循环（TCA）的重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢，在各个领域有着重要的应用前景[1]。作为一种营养强化剂，α-KG可广泛应用于食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中。传统工业上，采用有机合成法生产α-KG，涉及一系列复杂的化学反应过程，从而存在原料来源、环境污染等方面的问题[2]。为此，国内外很多学者对微生物发酵法生产α-KG进行了研究。作者室通过研究，实现了发酵法生产α-KG[3]，并在5 m3发酵罐上进行了中试。

离子交换法用于提取各种生物活性代谢物质具有成本低，工艺操作方便，提炼效率高，设备结构简单，以及节约大量的有机溶液等优点[4]。已有文献资料中也多见离子交换法用于有机酸等的提取。如李寅等[4]采用离子交换法从发酵液中提取丙酮酸；郑辉杰等[5]用离子交换法对发酵液中乳酸的提取工艺进行了研究；余炜等[6]采用离子交换法从发酵液中提取L-亮氨酸；王岸娜等[7]离子交换层析色谱法分离壳聚糖。α-KG发酵液中含有一定量的副产物丙酮酸，增加了纯化难度，有关α-KG的提取鲜有文献报道。作者以离子交换法对α-KG的提取纯化工艺进行了研究，为α-KG的提取与纯化提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

离子交换树脂：201×7、202、213、D201、D202、D301，浙江杭州争光树脂有限公司生产；粉末状活性炭：国药集团化学试剂有限公司生产；丙酮酸及α-KG试剂：购自生工生物工程（上海）有限公司；α-KG发酵液：作者所在实验室发酵制备（发酵菌种：Yarrowia lipolytica WSH-Z06）。

高速冷冻离心机：HITACHI公司产品；恒温摇床：上海欣蕊自动化设备有限公司产品；烘箱：上海货德实验设备有限公司产品；电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；UV2450紫外分光光度计：Shimadzu公司产品；HPLC高效液相色谱：Aglilen公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液预处理 采用静态法对发酵液进行脱色处理。发酵液脱色：将脱色前发酵液和脱色后发酵液进行全波长扫描，采取平均法来确定吸收波长[8]。采用单因素变量法优化脱色条件。在100 mL锥形瓶中加入25 mL发酵液，在不同的活性炭用量、pH、温度和脱色时间条件下，于恒温摇床上进行震荡脱色。测定脱色后发酵液的吸光度，计算脱色率：脱色率（%）=（脱色前发酵液吸光值－脱色后发酵液吸光值）/脱色前发酵液吸光值×100%

1.2.2 树脂的预处理及选型 树脂的预处理：见参考文献[9]。树脂的选型：通过静态试验来选择合适的树脂进行实验[4]。静态试验：准确量取已预处理好的离子交换树脂6 mL，分别放入内盛80 mL一定浓度的α-KG溶液的100 mL的锥形瓶中，在恒温摇床中28℃、200 r/min转速下震荡交换20 h，以减差法计算树脂平衡吸附量。

1.2.3 固定床动态吸附与洗脱 离子交换柱采用1×20 mm的玻璃层析住，树脂装填量为14 mL。将预处理过的发酵液进行上样，待树脂吸附饱和后，用超纯水洗去柱中残留的发酵液。然后用洗脱液进行洗脱。经过试验，采取阶段洗脱策略[10-11]。分别收集流出液、洗脱液，测定其中α-KG和丙酮酸含量，分析树脂的吸附情况以及α-KG和丙酮酸的分离情况。

1.2.4 分析方法 用HPLC法来检测α-KG和丙酮酸的含量[3]。将待测样品稀释一定倍数，过滤后，HPLC检测。流动相：5 mmol/L硫酸溶液（550 μL浓硫酸定容到2 L），用0.22 μm孔径的微滤膜抽滤并脱气。HPLC条件：Aminex HPX-87H ion exchange column，柱温：35 ℃，进样量：10 μL，流量：0.6 mL/min。检测器：紫外检测器；检测波长：210 nm。

2 结果与讨论

2.1 发酵液的脱色

2.1.1 吸收波长的确定 采用活性炭对发酵液进行脱色。将脱色前后的发酵液进行全波长扫描，如图1所示。全波长扫描图没有特征吸收峰，因此采用平均法[8]，计算得到平均脱色率为64.4%，在440 nm到450 nm之间。不同波长下吸收光的颜色和观察到的颜色之间的关系，如表1所示。而发酵液颜色呈浅黄色偏橙色，故确定440 nm为检测波长。

图1 全波长扫描Fig.1 Wavelength scanning

表1 吸收波长的颜色和观察到的颜色Table 1 Absorption of light color and observed color

2.1.2 活性炭用量对脱色效果的影响 活性炭用量对脱色效果的影响如图2所示。随着活性炭用量的增加，脱色率也不断增大，当活性炭用量为1.5 g/L时，脱色率达最大，为78.2%。故活性炭用量选择1.5 g/L。

图2 活性炭用量对脱色率的影响Fig.2 Effect of carbon dosage on decolorization rate of fermentation broth

2.1.3 脱色时间对脱色效果的影响 脱色时间对脱色效果的影响如图3所示。脱色率在1 h时脱色率达到最大，为78.1%。随着时间的延长，脱色率反而下降。分析原因可能是随着脱色时间的延长，活性炭上吸附的色素物质会有一定程度的解吸附现象，直到吸附达平衡状态。故选择脱色时间为1 h。

图3 脱色时间对脱色率的影响Fig.3 Effect of time on decolorization rate of fermentation broth

2.1.4 温度对脱色效果的影响 温度对脱色效果的影响如图4所示。随着温度的升高，脱色率也逐渐增大，在温度达50℃后，脱色率变化趋于平缓。升高温度，能促进分子的运动，有利于提高活性炭的吸附效率。综合能耗考虑，选择脱色温度为50℃。

2.1.5 pH对脱色效果的影响 pH对脱色效果的影响如图5所示。随着pH值的降低，脱色率逐渐增大，在pH 3.0时，脱色率最高，为71.3%。故最佳脱色pH值为3.0。

图4 温度对脱色率的影响Fig.4 Effect of temperature on decolorization rate of fermentation broth

图5 pH对脱色率的影响Fig.5 Effect of pH on decolorization rate of fermentation broth

综合以上脱色条件，进行脱色验证，结果活性炭对发酵液的脱色率达到89.2%，脱色后的发酵液澄清透明带有少许浅橙黄色 （440 nm下吸光值为0.015）。

2.2 树脂的选型

通过静态吸附试验，得到各树脂吸附能力，如表2所示。其中弱碱大孔型树脂D301和强碱凝胶型树脂202对α-KG具有较大的吸附容量，但D301的吸附容量最大，为109.3 mg/mL。而弱碱性树在洗脱时较强碱性树脂脂更易于目标产物的洗脱。故选择弱碱大孔型树脂D301作为本实验的离子交换材料。

2.3 固定床上样条件优化

2.3.1 流量对流出曲线的影响 空间流量对流出曲线的影响如图6所示。随着上样流量的增加，固液接触时间变短，交换区域拉长，穿透点提前，流出曲线拉平展开，这不利于提高树脂的利用率。在实验范围内选择较低的流量2.67 BV/h较为合理。在实际生产中，可以根据实际情况，在上样开始阶段以高流量上样，之后选择低流量上样至穿透，可以在保证柱子利用率的前提下，适当提高生产效率。

图6 不同流量对流出曲线的影响Fig.6 Effect of space velocity on the effluent curve

2.3.2 质量浓度对流出曲线的影响 上样质量浓度对流出曲线的影响如图7所示。当质量浓度较低为9.03 g/L时，曲线拉平展开，交换区间拉长；当质量浓度为20.3 g/L和33.9 g/L时，曲线前半部分变化趋势相似，但质量浓度为33.9 g/L时，曲线严重拖尾。分析原因可能是因为柱子体积较小导致吸附容量有限所致。故在实验范围内，α-KG的上样质量浓度选择为20 g/L较为合理，实际生产中可根据固定床大小来选择其合适的上样质量浓度。

图7 不同上样质量浓度对流出曲线的影响Fig.7 Effect of concentration of α-KG on the effluent curve

2.3.3 装填高度对流出曲线的影响 在不同的装填高度条件下进行上样，得到流出曲线，如图8所示。分析图中曲线发现，不同的径高比对流出曲线变化趋势的影响不大。当径高比为1∶24时，流出曲线坡度相对较缓，交换区域相对拉长，出现拖尾现象。分析原因可能主要是由于树脂装填不严实所致。故在实验条件下，选择径高比为1∶12较好。

图8 径高比对流出曲线的影响Fig.8 Effect of resin height on the effluent curve

2.4 洗脱条件优化

由于发酵液中存有较高比例的丙酮酸，故将二者分离是α-KG纯化过程中最关键的一步。经过试验，确定采取阶段洗脱策略来分离α-KG。

第一阶段采用混合洗脱剂低浓度 （0.01 mol/L NaCl和0.01 mol/L HCl混合液）下进行洗脱，在损失一定量的α-KG的同时，将丙酮酸大量洗脱下来；第二阶段则用HCl一次洗脱，可得到较纯的α-KG溶液。收集洗脱液，测定其中α-KG和丙酮酸的含量，得到阶段洗脱曲线，如图9所示。第一阶段洗脱体积240 mL，第二阶段洗脱体积150 mL。在第二阶段洗脱液中，丙酮酸的含量几乎为零，α-KG的纯化效果较好。分析图9发现，洗脱液中所含丙酮酸的比例要远远低于原始发酵液中丙酮酸的含量，说明D301树脂对α-KG的吸附选择性较大。

图9 阶段洗脱曲线Fig.9 Stepwise elution curve

对第二阶段洗脱液浓度和洗脱流量进行了优化，如图10所示。当洗脱流量为6 BV/h，洗脱剂浓度为0.3 mol/L HCl时，洗脱峰较集中，且峰高较大，洗脱效果最佳。

图10 不同流量对第二阶段洗脱曲线的影响Fig.10 Effect of elution velocity on elution curve

2.5 洗脱验证

上样至刚好穿透，记上样体积V0，收集上样流出液和洗柱液V1，第一阶段洗脱液V2，第二阶段洗脱液V3，测定其中α-KG和丙酮酸的含量，计算得率，结果如表3所示。在第一阶段洗脱时，丙酮酸洗脱量为56.74 mg，远远大于α-KG的洗脱量6.21 mg；第二阶段中，α-KG 大量洗脱，为93.67 mg。在上述阶段洗脱策略下，最终α-KG收率达93.2%。在93.67 mg α-KG中含丙酮酸9.59 mg，由初始发酵液中α-KG与丙酮酸质量比1.5∶1提高到10∶1，更有利于后续的结晶。如果延长第一阶段洗脱时间，则最终α-KG纯度可进一步提高至完全不含丙酮酸，但α-KG的收率会有所下降。对比V0和V1中α-KG和丙酮酸的含量可知，D301树脂对α-KG的吸附选择性较大。因此可以设计串联柱过量上样，然后分柱洗脱，有助于α-KG和丙酮酸的分离。

表3 纯化结果验证Table 3 Consequence of purification

3 结语

通过全波长扫描，采取平均法确定检测波长为440 nm。用活性炭对发酵液进行脱色，在活性炭用量1.5 g/L、pH 3.0、脱色时间 1 h、脱色温度 50℃的条件下，脱色率可达89.2%。通过静态试验，选择吸附量最大的弱碱大孔型树脂D301为实验用离子交换树脂。上柱条件优化表明，在发酵液中α-KG质量浓度20 g/L、较低的流量（2.67 BV/h）和较小的装填高度（D∶H=1∶12）时，上样吸附效果最好。 采用阶段洗脱：第一阶段用0.01 mol/L的NaCl和0.01 mol/L的HCl混合溶液进行洗脱，第二阶段采用0.3 mol/L的HCl溶液进行洗脱，洗脱流速6 BV/h。在此工艺条件下验证，洗脱液中α-KG与丙酮酸的质量比由初始发酵液中的 1.5∶1 提高为 10∶1，α-KG 收率可达93.2%，纯化效果较好。该工艺可较好的纯化α-KG，但依然存在一定的损失，而且丙酮酸完全浪费，可进一步尝试其他洗脱策略，提高α-KG收率，并尽可能分离出丙酮酸，实现副产物的利用。

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