Sorcin的表达影响人胶质瘤细胞对顺铂的敏感性*

刘 宁， 孙连坤， 杨晓春， 马丽伟， 苏 静

多药耐药是临床肿瘤治疗面临的严重问题。研究表明可溶性耐药相关钙结合蛋白(soluble resistance-related calcium-binding protein，sorcin)在白血病、胃癌、卵巢癌等多种肿瘤耐药细胞中高表达，且表达量与耐药性呈一定的相关性［1-2］。有证据显示，在多种耐药细胞中，出现了编码P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的基因和编码sorcin的基因共扩增的现象，还出现多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)的高表达。多药耐药基因1编码的P-gp是一种ATP依赖的外排泵，可将多种物质包括化疗药物排出细胞外，降低细胞内的药物浓度，P-gp在多药耐药细胞中的重要作用已经被证实［3-4］。尽管有研究报道sorcin的过度表达伴随着P-gp的过度表达［5-6］，但sorcin在胶质瘤中的表达以及与胶质瘤P-gp的关系目前尚未有报道。本实验通过RNA干扰的方法沉默胶质瘤U251细胞中sorcin的表达，观察抑制sorcin表达对U251细胞顺铂敏感性的影响，并进一步探讨sorcin参与胶质瘤细胞耐药的机制。

材料和方法

1 主要试剂

十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺和甘氨酸购自长春宝信生物技术责任有限公司;氨苄青霉素、琼脂糖、琼脂粉、胰蛋白胨及酵母提取物购自Oxoid;全部引物合成与测序、质粒提取试剂盒、T4 DNA连接酶、BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶、DNA凝胶回收试剂盒、MMV逆转录酶和DNA marker购自大连宝生物(TaKaRa)工程公司;脂质体Lipofectamine 2000、Trizol和新生牛血清购自Invitrogen;IMDM培养基购自HyClone;sorcin、P-gp和MRP1抗体购自Santa Cruz;β-actin抗体购自Epitomics;Ⅱ抗购自Pierce。

2 细胞

人神经胶质瘤U251细胞系由吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室保存。U251细胞培养在37℃、5%CO2培养箱中，用含10%新生牛血清的IMDM培养基常规方法培养，0.25%胰酶消化传代，取处于对数生长期细胞分组进行实验。

3 主要方法

3.1 sorcin特异性siRNA表达载体pSilencerTM3.1-H1-sorcin siRNA的构建 siRNA表达载体选用pSilencerTM3.1-H1(Amion)。根据GenBank人源sorcin mRNA已知序列，针对编码区选择位点设计1段碱基序列TGCTGGATAGAGATATGTC，按质粒说明书在www.ambion.com在线设计siRNA模板序列:正义链5'-GAT CCG TGC TGG ATA GAG ATA TGT CTT CAA GAG AGA CAT ATC TCT ATC CAG CAT TTT TTG GAA A-3'，反义链为 5'-AGC TTT TCC AAA AAA TGC TGG ATA GAG ATA TGT CTC TCT TGA AGA CAT ATC TCT ATC CAG CAC G-3'。sorcin siRNA模板寡核苷酸退火:各取2 μL模板，加入46 μL 1× DNA退火溶液，总体积为50 μL，90℃ 3 min，降温至37℃，孵育1 h;将退火的sorcin siRNA模板寡核苷酸连接到线性化的pSilencerTM3.1-H1 siRNA表达载体:取退火的sorcin siRNA模板寡核苷酸5 μL，加45 μL去核酸酶水稀释，T4 DNA连接酶1 μL，10×T4 DNA连接 buffer 1 μL，载体 1 μL，加去核酸酶水 6 μL 至总体积为10 μL，4℃孵育过夜。

3.2 连接产物转化JM109大肠杆菌感受态细胞取100 μL大肠杆菌JM109感受态细胞，加入连接反应产物5 μL混匀，冰浴30 min。42℃水浴90 s，迅速冰浴2 min。加入LB液体培养基800 μL，37℃温和振荡培养1 h。取200 μL菌液接种到含氨苄青霉素(50 mg/L)的LB平板，倒置平皿37℃培养16～20 h，观察菌落生长情况。

3.3 阳性重组克隆的筛选、扩增及质粒提取 挑取LB平板的单菌落加到含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16 h，按质粒试剂盒说明书提取质粒。

3.4 重组质粒的鉴定和测序 用限制性内切酶BamHⅠ和 HindⅢ对 pSilencerTM3.1-H1-sorcin siRNA重组质粒(Si-sorcin)进行双酶切(质粒8 μL;BamH I 1 μL;HindⅢ 1 μL;10 × H buffer 2 μL;ddH2O 8 μL;总体积20 μL，混匀，37 ℃ 水浴2 h)，取5 μL 酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，释放出目的片段的质粒为阳性重组质粒。阳性质粒经上海生工生物工程技术服务有限公司自动测序仪测序。

3.5 Si-sorcin转染U251细胞 转染细胞分为Siscramble组(空载体对照组)和Si-sorcin组，将对数生长期U251细胞接种于100 mm平皿中，待细胞生长融合率达到80～90%，按Lipofectamine 2000说明书将质粒转染到U251细胞中:取16 μg质粒溶于IMDM培养液(不含血清)，终体积为800 μL;将40 μL Lipofectamine 2000溶于800 μL IMDM 培养液(不含血清)中;将上述2种液体混匀，室温孵育20 min，以形成DNA-Lipofectamine 2000复合物。U251细胞用IMDM培养液(不含血清)洗3次，加入DNA-Lipofectamine 2000复合物，37℃、5%CO2培养箱培养;4 h后用含10%血清IMDM培养液洗3次，加10 mL含10%血清IMDM培养液，继续培养24 h。

3.6 RT-PCR检测 U251细胞分别转染Si-scramble和Si-sorcin质粒后，离心收集细胞，Trizol法提取总RNA，每组按照AMV逆转录酶(TaKaRa)说明书进行第1链cDNA合成，将合成的cDNA进行PCR扩增反应。2 × Taq Master 12.5 μL，cDNA 2 μL，引物各10 μL，用 ddH2O将反应体系补至25 μL。取10 μL扩增产物，2%琼脂糖凝胶进行DNA电泳，采用天能凝胶成像系统拍照。引物序列如表1所示，扩增条件为:94℃ 2 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，27～30个循环，72 ℃ 10 min。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.7 Western bloting检测 U251细胞分别转染Siscramble和Si-sorcin质粒后，离心收集细胞，冷PBS洗涤2次，加入细胞裂解液并提取蛋白，测浓度后取60 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，采用Bio-Rad转移装置将蛋白移至PVDF膜，转膜结束后将PVDF膜放入5% 的脱脂奶粉中1～2 h，封闭膜上的非特异结合位点，分别加入Ⅰ抗(β-actin、sorcin、P-gp 和MRP1)，4℃冰箱中过夜。次日PBST洗膜3次，分别为15 min、5 min 和 5 min，再分别加入 1∶1 000 稀释的鼠、兔和山羊Ⅱ抗室温孵育1.5 h，倒掉Ⅱ抗，PBST洗膜3次，DAB显色，凝胶成像系统采集图像后保存。

3.8 MTT法检测细胞生存率 U251细胞分别转染Si-scramble和 Si-sorcin 质粒后，加入 0、1.25、2.5、5、10和20 mg/L顺铂，每个浓度设5个复孔，作用24 h，每孔加入20 μL MTT，孵育4 ～6 h，弃掉培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡器振荡10 min充分溶解甲臜颗粒，酶标仪上选取490 nm波长，测定各孔的吸光度，记录结果。

4 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 11.5软件分析，组间均值比较采用ANOVA检验。电泳条带密度值以灰度×面积/参照物的比值表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Si-sorcin表达载体的酶切及测序鉴定

质粒试剂盒提取质粒后，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切连接有目的片段的Si-sorcin表达质粒，2%琼脂糖凝胶电泳，获得66 bp的目的片段，见图1。对该片段进行DNA测序，结果证实sorcin siRNA片段与pSilencerTM3.1-H1 siRNA共表达载体连接反应正确。

2 转染Si-sorcin表达载体对U251细胞sorcin mRNA表达的影响

U251细胞分别转染Si-scramble和Si-sorcin，RTPCR结果如图2所示，与未转染的对照细胞相比，转染Si-scramble U251细胞其sorcin mRNA表达无明显变化(P＞0.05)，转染Si-sorcin的U251细胞其sorcin mRNA表达明显降低(P＜0.05)。

Figure 1.Identification of Si-sorcin expression plasmid by restriction enzyme digestion.M:DL2000 DNA marker;Lane 1:Si-sorcin plasmid;Lane 2:Si-sorcin plasmid digested by BamHⅠ and HindⅢ.图1 Si-sorcin表达质粒的酶切鉴定

Figure 2.RT-PCR analysis of sorcin mRNA expression in U251 cells transfected with siRNA.Lane 1:control;Lane 2:Si-scramble plasmid;Lane 3:Si-sorcin plasmid.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.图2 转染Si-sorcin表达质粒后U251细胞sorcin mRNA表达的变化

3 转染Si-sorcin表达载体对U251细胞的sorcin蛋白表达的影响

U251细胞分别转染 Si-scramble和 Si-sorcin，Western blotting结果如图3所示，与未转染的对照细胞相比，转染Si-scramble的U251细胞sorcin蛋白表达无明显变化(P＞0.05)，转染Si-sorcin的 U251细胞sorcin蛋白表达明显降低(P＜0.05)。

4 抑制sorcin表达后U251细胞对顺铂敏感性的变化

U251细胞分别转染Si-scramble和Si-sorcin后，用不同浓度顺铂作用24 h，检测各组细胞的生存率。在不同浓度顺铂作用下，与control组相比，Si-scramble组的细胞生存率无明显变化(P＞0.05)，而Sisorcin组的细胞生存率明显降低(P＜0.05)，见图4。Control组、Si-scramble组和Si-sorcin组的顺铂IC50分别为12.0 mg/L、11.8 mg/L 和 6.5 mg/L，提示抑制sorcin的表达能明显降低U251细胞的生存率，增加U251细胞对顺铂的敏感性。

Figure 3.Western blotting analysis of sorcin protein expression in U251 cells transfected with siRNA.Lane 1:control;Lane 2:Si-scramble plasmid;Lane 3:Si-sorcin plasmid.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.图3 转染Si-sorcin表达质粒后U251细胞sorcin蛋白表达的变化

Figure 4.The viability of U251 cells transfected with siRNA under the condition of cisplatin exposure.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.图4 转染Si-sorcin表达质粒后U251细胞在不同浓度顺铂处理下的存活率

5 抑制sorcin表达对P-gp和MRP1蛋白表达的影响

U251细胞转染Si-scramble和Si-sorcin后，Western blotting结果显示，与 control组相比，转染 Siscramble的U251细胞MRP1和P-gp蛋白的表达无明显变化(P＞0.05)，而转染Si-sorcin的U251细胞MRP1和P-gp蛋白的表达明显降低(P＜0.05)，见图5。

Figure 5.The protein expression of P-gp and MRP1 in U251 cells transfected with siRNA.Lane 1:control;Lane 2:Si-scramble plasmid;Lane 3:Si-sorcin plasmid.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.图5 转染Si-sorcin表达质粒后U251细胞P-gp和MRP1蛋白表达的变化

讨 论

肿瘤耐药的形成是多基因、多种分子机制共同作用的结果［7］。耐药基因及其相关蛋白包括:多药耐药基因1及其产物P-gp、MRP1、乳腺癌耐药相关蛋白 (breast cancer resistance protein，BCRP)和肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein，LRP)等，这些耐药基因的异常表达与肿瘤耐药之间存在广泛联系［8-11］。Sorcin是1986年首次在长春新碱诱导的中国仓鼠多药耐药细胞株中发现的一种胞浆蛋白，分子量为22 kD，其表达和功能与肿瘤耐药相关［12］。

本实验设计sorcin RNA干扰靶位点并连接到表达载体，经双酶切和测序鉴定表明，sorcin siRNA表达载体构建成功。通过RT-PCR和Western blotting检测，可见转染Si-sorcin明显抑制U251细胞的sorcin mRNA和蛋白的表达。MTT结果显示，抑制sorcin基因表达可以增加U251细胞对顺铂的敏感性，提示sorcin基因可能参与了胶质瘤对顺铂的耐药过程。

近来研究表明，sorcin是一个磷酸化的钙结合蛋白，可以改变细胞内钙离子浓度，从而影响钙相关信号转导，使受钙调节的蛋白活性与功能发生改变［2，13］。由多药耐药基因1编码的 P-gp是一种膜糖蛋白，具有ATP结合位点，依赖ATP可以将多种化疗药物排出细胞外，从而降低细胞内的药物浓度，导致多药耐药［14］。磷酸化的P-gp是有活性的，sorcin作为一种钙结合蛋白，可能通过参与调节细胞内钙水平来调控P-gp的磷酸化状态，从而影响P-gp的功能［15］。本实验结果显示，抑制sorcin基因可以降低细胞中P-gp和MRP1蛋白的表达，因此推测sorcin可能是P-gp工作单位的一部分，在与P-gp相互作用的过程中介导耐药。

综上所述，调节sorcin基因的表达是影响胶质瘤U251细胞对顺铂耐药的一个重要因素，特异性抑制sorcin基因表达可抑制耐药基因的效应，增加U251细胞对顺铂的敏感性。基于sorcin这一靶点设计合成新的耐药逆转剂，有可能成为逆转胶质瘤多药耐药的新策略。

［1］ 何青春，张桂英，曹伟军.Sorcin高表达与胃癌细胞株SGC7901多药耐药的关系［J］.癌症，2008，27(4):337-342.

［2］ Parekh HK，Deng HB，Choudhary K，et al.Overexpression of sorcin，a calcium-binding protein，induces a low level of paclitaxel resistance in human ovarian and breast cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2002，63(6):1149-1158.

［3］ Zhu H，Liu Z，Tang L，et al.Reversal of P-gp and MRP1-mediated multidrug resistance by H6，a gypenoside aglycon from Gynostemma pentaphyllum，in vincristine-resistant human oral cancer(KB/VCR)cells［J］.Eur J Pharmacol，2012，696(1-3):45-53.

［4］ Yuan J，Wong IL，Jiang T，et al.Synthesis of methylated quercetin derivatives and their reversal activities on P-gP-and BCRP-mediated multidrug resistance tumour cells［J］.Eur J Med Chem，2012，54:413-422.

［5］ Zheng BB，Zhang P，Jia WW，et al.Sorcin，a potential therapeutic target for reversing multidrug resistance in cancer［J］.J Physiol Biochem，2012，68(2):281-287.

［6］ Tan Y，Li G，Zhao C，et al.Expression of sorcin predicts poor outcome in acute myeloid leukemia［J］.Leuk Res，2003，27(2):125-131.

［7］ Gottesman MM.Mechanisms of cancer drug resistance［J］.Annu Rev Med，2002，53:615-627.

［8］ 宋现让，魏 玲，王兴武，等.骨软组织肉瘤中耐药相关蛋白表达及与化疗耐药的相关性［J］.中国病理生理杂志，2006，22(10):2012-2017.

［9］ Mattern J.Drug resistance in cancer:a multifactorial problem［J］.Anticancer Res，2003，23(2C):1769-1772.

［10］夏忠胜，朱兆华，陈其奎，等.靶向 MRP1基因的RNAi稳定逆转结肠癌细胞的多药耐药性［J］.中国病理生理杂志，2009，25(5):898-903.

［11］卓家才，游伟文，蔡力生，等.K562/AS2细胞株对三氧化二砷耐药机制的初步研究［J］.中国病理生理杂志，2008，24(10):2054-2056.

［12］Van der Bliek AM，Meyers MB，Biedler JL，et al.A 22-kd protein(sorcin/V19)encoded by an amplified gene in multidrug-resistant cells，is homologous to the calciumbinding light chain of calpain［J］.EMBO J，1986，5(12):3201-3208.

［13］ Maddalena F，Laudiero G，Piscazzi A，et al.Sorcin induces a drug-resistant phenotype in human colorectal cancer by modulating Ca2+homeostasis［J］.Cancer Res，2011，71(24):7659-7669.

［14］邵淑丽，崔婷婷，贾红双，等.靶向MRP1基因的shRNA稳定逆转肺癌的多药耐药性［J］.中国病理生理杂志，2011，27(12):2265-2269.

［15］ He Q，Zhang G，Hou D，et al.Over expression of sorcin results in multidrug resistance in gastric cancer cells with up-regulation of P-gp［J］.Oncol Rep，2011，25(1):237-243.