艾塞那肽对1型糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶亚单位表达的影响

刘晋津，郭志新，齐伟，吴杰萍，杜时晶，俞媛贤

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的微血管并发症，也是1型糖尿病患者死亡的主要原因之一。研究证实，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)氧化酶及其产物活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)所致的氧化应激与DN的发生发展密切相关[1]。胰高血糖素样肽1(GLP-1)是一种由肠道L细胞分泌的肠促胰岛素，其主要生理功能是改善血糖控制[2]。但越来越多的证据表明，GLP-1还可通过与肾组织表达的GLP-1受体结合发挥肾脏保护作用[3-5]。本研究观察GLP-1受体激动剂艾塞那肽对1型糖尿病大鼠肾脏组织NADPH氧化酶亚单位和结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响，探讨其对1型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立及分组 30只6周龄雄性SD大鼠(购自山西医科大学实验动物中心)，体重200～220g，适应性喂养1周后随机分为正常对照组(A组，n=7)和糖尿病造模组(n=23)。糖尿病造模组给予链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，枸橼酸缓冲液配制)65mg/kg腹腔注射，对照组给予等量生理盐水腹腔注射。72h后尾静脉采血测血糖，随机血糖≥16.7mmol/L为糖尿病造模成功，共有19只大鼠造模成功。将造模成功的19只1型糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组(B组，n=10)和艾塞那肽治疗组(C组，n=9)。3组大鼠继续常规饲料喂养，自由饮水。C组给予艾塞那肽5μg/kg，2次/d皮下注射，A组和B组给予等量生理盐水皮下注射，共干预治疗8周。

1.2 标本的采集 艾塞那肽干预治疗8周后，于实验结束前1d用代谢笼留取24h尿标本，保存于－20℃冰箱中，用于测定尿白蛋白排泄率。动物禁食10～12h后称重，用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，留取血标本用于检测血糖、血脂、血肌酐、尿素氮、血胰岛素水平。留取血标本后处死动物并迅速取出肾脏，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称肾脏重量，计算肾脏指数(肾脏重量/大鼠体重)。分离肾皮质，一部分用中性甲醛液固定，脱水，石蜡包埋，常规切片，用于制作病理切片及免疫组织化学染色；其余部分迅速投入液氮中，冻透后储存于－70℃冰箱，采用实时荧光定量PCR方法测定肾脏NOX4及p22phox mRNA表达。

1.3 指标检测 血糖采用葡萄糖氧化酶法测定。血甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、血肌酐、尿素氮均采用全自动生化分析仪测定。血浆胰岛素及24h尿白蛋白用放射免疫法测定。

1.4 肾脏组织NOX4和p22phox mRNA表达检测采用Trizol试剂提取肾脏组织总RNA。用RT-PCR试剂盒进行反转录制备cDNA，采用实时荧光定量PCR仪进行扩增。引物序列如下：p22phox，上游5'-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3'，下游5'-TCACACGACCTCATCTGTCAC-3'，扩增产物片段长度457bp；Nox4，上游5'-TAGCTGCCCACヰ GG TGAACG-3'，下游5'-TGTAACCATGAGGAACAATA CCACC-3'，扩增产物片段长度245bp；内参β-actin，上游5'-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'，下游5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3'，扩增产物片段147bp。PCR扩增条件：预变性94℃10min；变性94℃ 15s、退火60℃ 60s、延伸72℃45s，共循环45次。目的基因表达阳性的标本荧光定量扩增曲线呈S形，采用实时荧光定量PCR电脑系统读取Ct值，以2–ΔΔCt表示样品中目的基因mRNA相对于对照组的表达量。

1.5 肾脏组织CTGF蛋白的检测 采用免疫组化SABC法，染色流程按试剂说明书进行。一抗稀释比例1:400(兔抗CTGF多克隆抗体，兔抗Cu-Zn-SOD多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司)，二抗(武汉博士德生物工程有限公司)稀释比例1:100，采用DAB显色方法。光镜下每张切片随机选取5个视野进行观察，以出现棕黄色颗粒为阳性。用图形分析软件测定CTGF阳性表达的平均灰度值。胞质内表达颜色越深，其平均灰度值越小，阳性物质含量越大。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。所有数据均以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠生化指标比较 B组大鼠空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸水平均显著高于A组，但血浆胰岛素水平显著低于A组(P＜0.05)。经艾塞那肽干预治疗8周后，C组大鼠总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平与B组比较均明显降低(P＜0.05)，而血糖和胰岛素水平与B组比较差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

2.2 各组大鼠肾功能、尿白蛋白和肾脏质量指数比较 B组大鼠血尿素氮、肌酐、尿白蛋白和肾脏指数显著高于A组(P＜0.05)。经艾塞那肽治疗的C组大鼠，其尿素氮、肌酐、尿白蛋白和肾脏指数显著低于B组(P＜0.05，表2)。

2.3 各组大鼠肾脏NADPH氧化酶亚单位NOX4和p22phox mRNA表达比较 B组糖尿病大鼠肾脏NOX4和p22phox mRNA相对表达量(分别为1.57±0.19、3.27±0.72)显著高于A组(分别为0.71±0.43、0.84±0.44，P＜0.05)。经艾塞那肽治疗后，C组大鼠肾脏NOX4和p22phox mRNA相对表达量(分别为1.05±0.41、1.26±0.57)与B组比较显著降低(P＜0.05)。

表1 各组大鼠生化指标比较Tab.1 Comparison of biochemical indexes among the 3 groups of rats )

表1 各组大鼠生化指标比较Tab.1 Comparison of biochemical indexes among the 3 groups of rats )

FPG. Fasting plasma glucose; TC. Total cholesterol; TG. Triglycerides; FFA. Free fatty acid; FINS. Fasting insulin. (1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group B

Group FPG(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) FFA(mmol/L) FINS(U/ml)A(n=7) 4.31±0.72 1.46±0.38 0.83±0.13 1.45±0.20 19.36±0.58 B(n=10) 29.86±1.32(1) 2.79±0.29(1) 1.42±0.20(1) 2.60±0.41(1) 4.91±0.27(1)C(n=9) 28.6±0.89 2.27±0.72(2) 1.08±0.87(2) 1.53±0.34(2) 5.19±0.31

表2 各组大鼠肾功能、尿白蛋白和肾脏质量指数比较s)Tab.2 Comparison of renal function, urine protein and the ratio of kidney weight/body weight among the 3 groups of rats±s)

表2 各组大鼠肾功能、尿白蛋白和肾脏质量指数比较s)Tab.2 Comparison of renal function, urine protein and the ratio of kidney weight/body weight among the 3 groups of rats±s)

BUN. Blood urea nitrogen; Cr. Serum creatinine. (1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group B

Group BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) Urine protein (mg/24h) Kindey weight/body weight (g/kg)A(n=7) 7.64±1.80 192.38±22.44 5.41±0.85 6.11±0.45 B(n=10) 14.58±4.89(1) 386.84±46.45(1) 31.02±4.01(1) 11.21±1.01(1)C(n=9) 10.71±2.92(2) 228.04±38.4(2) 22.09±3.03(2) 9.19±0.86(2)

2.4 各组大鼠肾脏组织形态学观察 正常对照组肾脏结构清晰，肾小球基底膜厚度均匀一致，无足突细胞融合。糖尿病组肾脏结构模糊不清，肾小球基底膜增厚，足突增粗、破坏、融合、消失，系膜基质增多、肿胀，系膜区扩大，系膜细胞肿胀，肾小管细胞增生肥大，管腔变窄并出现空泡样变。艾塞那肽治疗组基底膜厚度、肾小管管腔狭窄程度较糖尿病组明显降低，有少量足突细胞融合，系膜区细胞仅可见轻度增生(图1)。

2.5 各组大鼠肾脏组织CTGF蛋白表达比较CTGF在正常肾脏组织的肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞均呈阳性表达。B组大鼠肾组织CTGF阳性表达的平均灰度值与A组比较明显降低(P＜0.05)，提示B组大鼠肾组织CTGF阳性表达明显增强。C组大鼠肾组织CTGF阳性表达的平均灰度值较B组明显升高(P＜0.05)，提示C组大鼠肾组织CTGF阳性表达明显降低(图2、表3)。

3 讨 论

本实验结果显示，糖尿病大鼠肾脏NOX4、p22phox mRNA和CTGF蛋白表达均显著增高，提示其氧化应激水平增高。艾塞那肽干预治疗8周后，糖尿病大鼠肾脏NOX4、p22phox mRNA表达显著降低，肾脏CTGF蛋白表达降低，蛋白尿减轻，肾脏肥大指数降低，提示艾塞那肽能显著降低糖尿病大鼠的氧化应激水平，减轻氧化应激对肾脏的损伤，对肾脏有保护作用。

图1 各组大鼠肾脏HE染色结果(×250)Fig.1 HE staining of kidney in the 3 groups of rats (×250)

图2 各组大鼠肾脏CTGF免疫组织化学染色结果(×400)Fig.2 Immunohistochemistrial staining of renal CTGF in the 3 groups of rats (×400)

表3 各组大鼠肾脏组织CTGF蛋白表达的比较)Tab.3 Comparison of the protein expression of renal CTGF among the 3 groups of rats (gray value,±s)

表3 各组大鼠肾脏组织CTGF蛋白表达的比较)Tab.3 Comparison of the protein expression of renal CTGF among the 3 groups of rats (gray value,±s)

(1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group B

Group Glomerular CTGF Renal tubular CTGF A(n=7) 158.97±6.63 163.32±4.76 B(n=10) 104.06±11.55(1) 112.26±4.65(1)C(n=9) 130.15±5.22(2) 134.06±2.20(2)

DN是引起终末期肾衰的主要原因之一[6]。氧化应激在DN的发生发展中起重要作用[1]。氧化应激水平是由活性氧簇(ROS)和抗氧化防御系统之间的平衡决定的[7]，当ROS生成超过机体抗氧化能力时，就会产生氧化应激和氧化损伤[8-9]。糖尿病氧化应激水平升高与NADPH氧化酶活化有关[1]。在糖尿病鼠肾脏中，NADPH氧化酶亚基Nox4和P22phox表达上调，NADPH氧化酶依赖的ROS产生增多引起肾脏DNA损伤，是DN发展的重要原因[1]。使用药物抑制NADPH氧化酶活性，减少其表达，能降低糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平，抑制肾小球基质沉积，减少尿蛋白，减缓DN的进展[1,7,10]。CTGF是一种致纤维化生长因子，在组织器官纤维化的发生中起重要作用[11]。CTGF具有促进细胞增殖分化、血管生成、基质合成积聚等作用，在DN肾小球硬化及肾间质纤维化中具有非常重要的作用。本研究结果显示，糖尿病大鼠肾脏NOX4和p22phox mRNA表达水平显著升高，导致糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平升高，作用于糖尿病大鼠肾脏而引起肾组织损伤，进一步导致肾脏CTGF蛋白表达增加，肾脏肥大指数和尿白蛋白增加，肾脏病理改变加重，提示NADPH氧化酶可能在DN的发生发展中起重要作用。

GLP-1是一种由肠道L细胞分泌的肠促胰岛素，与胰岛素分泌和糖代谢调节密切相关[12-14]。本研究结果显示，艾塞那肽治疗8周后，1型糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶亚单位NOX4和p22phox mRNA表达显著降低，肾脏CTGF表达减少，尿白蛋白减少，肾脏肥大及病理改变减轻，提示艾塞那肽对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用，其机制可能与抑制肾组织氧化应激有关。

本研究结果还显示，艾塞那肽对1型糖尿病大鼠血糖和胰岛素水平无明显影响。GLP-1的主要作用是刺激胰岛素分泌，改善血糖控制。本实验使用的动物模型是STZ诱导的1型糖尿病大鼠模型，其胰岛B细胞几乎完全被破坏，胰岛素分泌量极低，GLP-1作用于胰岛B细胞未能有效刺激胰岛素分泌，因此血胰岛素和血糖水平无明显变化。本实验一次性给予大剂量STZ选择性破坏胰岛B细胞制备1型糖尿病大鼠模型。由于STZ对胰岛B细胞有高度选择性而对肾脏毒性作用较弱，且STZ在体内半衰期较短，对肾脏的毒性作用很快消失，而高血糖持续存在。因此，造模成功8周后，STZ诱导的1型糖尿病大鼠肾脏结构及功能变化是由高血糖引起而不是STZ直接毒性作用造成的。

综上所述，本研究结果显示，1型糖尿病大鼠肾脏组织NADPH氧化酶亚单位NOX4、p22phox和CTGF表达增加，尿白蛋白升高，肾脏肥大，肾脏组织病理改变加重。艾塞那肽治疗后，1型糖尿病大鼠肾脏组织NADPH氧化酶亚单位NOX4、p22phox和CTGF的表达降低，尿白蛋白减少，肾脏肥大和肾脏病理改变减轻，对肾脏产生保护作用。后续研究拟在体和离体实验中，加入GLP-1受体激动剂和GLP-1受体拮抗剂，观察1型糖尿病大鼠肾脏和肾脏细胞NOX4、p22phox和CTGF表达的变化，以进一步阐明GPL-1与肾脏组织NADPH氧化酶亚单位表达之间的关系。

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