癌蛋白HBXIP对卵巢癌细胞增殖功能的影响

徐福强，杨莹，张晓东，叶丽虹，姚元庆

乙肝病毒X蛋白结合蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)是一种新发现的癌蛋白，由于它与乙肝病毒X蛋白结合而命名。研究发现HBXIP能与人体内多种蛋白结合，参与细胞凋亡与增殖﹑细胞周期进程﹑中心体复制﹑肿瘤细胞迁移等过程[1-4]。HBXIP是一个多功能的调节蛋白，可通过调节不同的转录因子影响基因表达[5-6]。HBXIP还参与mTORC1信号通路和氨基酸代谢[7]。但目前尚未见卵巢癌中HBXIP表达的相关研究。Skp2是一种重要的细胞增殖周期调节因子[8]，在卵巢癌中高表达[9]，最新研究表明HBXIP可以通过Skp2途径促进乳腺癌细胞的增殖[6]。本研究探讨HBXIP基因对卵巢癌细胞增殖功能的影响，以及可能的作用机制，旨在为HBXIP成为治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 真核表达载体与细胞株 真核表达载体pGL3-Basic，pCMV-Tag2B和pCMV-HBXIP由本室保存[10]。卵巢癌SKOV3细胞由南开大学医学院赵青博士惠赠。

1.1.2 引物设计 针对GenBank报道的Skp2启动子的基因片段(NC-000005.9)设计引物，5'端添加限制性内切酶Hind Ⅲ酶切位点，3'端添加Xho Ⅰ酶切位点。引物序列如下：正义链，5'-CGGGGTACCCCG TCCCTTCTTTACACCAATCTC-3'；反义链，5'-CC GCTCGAGCGGCGTTTACCTGTGCATAGCG-3'。针对HBXIP的核酸序列(NM_006402)设计引物：正义链，5'-ATGGAGCCAGGTGCAGGTC-3'；反义链，

5'-TGGAGGGATTCTTCATTGTG-3'。GAPDH作为内参，正义链，5'-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'；反义链，5'-TGACCTTGCCCACAGCCTTG-3'。引物由北京华大基因生物公司合成。

1.1.3 主要试剂 RPMI 1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司；M-MLV反转录酶﹑Taq DNA聚合酶﹑T4DNA连接酶及限制性内切酶均为宝生物(大连)生物工程有限公司产品；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；ECL Western blotting显色试剂盒购自Amersham Biosciences公司；MTT试剂﹑β-actin单克隆抗体及HBXIP多克隆抗体购自Sigma公司；Skp2多克隆抗体购自Boster公司；双荧光素酶测试试剂盒购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用RPMI 1640培养基培养卵巢癌SKOV3细胞，培养基中含有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素，在37℃孵箱5% CO2条件下培养。

1.2.2 反转录PCR 用Trizol法提取卵巢癌细胞系SKOV3的总RNA，通过M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，以此为模板进行PCR反应，以超纯水作为对照。取PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察结果并照相记录。实验均重复3次，Quantity One软件分析电泳条带灰度。

1.2.3 真核表达载体pGL3-Skp2启动子的构建构建真核表达载体pGL3-Skp2启动子，以卵巢癌SKOV3细胞基因组为模板，通过PCR方法扩增Skp2启动子区域，酶切后嵌入表达载体pGL3-Basic。转化到感受态细胞Trans5α中，通过氨西林抗性筛选阳性克隆，然后进行载体酶切和序列测定。

1.2.4 瞬时转染 真核表达载体pCMV-HBXIP质粒由本室构建[11]。将上述pCMV-HBXIP质粒瞬时转染SKOV3细胞作为实验组，pCMV-Tag2B载体转染SKOV3细胞为对照组，转染方法参照Lipofetamine 2000说明书，转染前24h将细胞传代，待细胞生长至60%～70%融合后进行转染，6h后更换为含10%胎牛血清的完全培养基。

1.2.5 平板克隆 将pCMV-HBXIP和pCMV-Tag2B质粒分别转染入卵巢癌细胞SKOV3，作为实验组和对照组，培养至对数生长期，分别计数后按每板500个细胞接种至6孔细胞培养板中。常规培养2周后行甲醇固定，亚甲基蓝染色，镜下计数细胞数多于50个的克隆数并照相记录。

1.2.6 MTT分析 胰酶消化生长至对数期的卵巢癌细胞[12]，计数并调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于96孔板，各孔细胞数约为1×103个。每组设6个平行孔，待细胞贴壁后分别转染pCMV-HBXIP及pCMV-Tag2B质粒，于37℃﹑5%CO2条件下培养箱中培养。分别在0﹑48h，加入20μl浓度为5g/L的MTT，继续培养4h，吸去孔内培养液，再加入150ml DMSO，室温振荡10min，用酶标仪(波长570nm)测定各孔的吸光度(A)值。

1.2.7 荧光素酶报告基因分析 为研究HBXIP促进卵巢癌细胞增殖的机制，我们克隆了Skp2启动子，并检测HBXIP对Skp2启动子活性的影响。将质粒pRL-TK﹑pGL3-Skp2及pCMV-HBXIP(或pCMVTag2B)共转染至SKOV3细胞中，以海肾荧光素酶表达载体pRL-TK为内参。转染48h后按照荧光素酶试剂盒说明测定光输出值。每组实验重复3次，以pCMV-Tag2B质粒为对照。

1.2.8 Western blotting检测 用预冷的PBS洗细胞2次，加入细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl﹑pH8.0﹑1mmol/L EDTA﹑150mmol/L NaCl﹑1mmol/L PMSF﹑1% NP-40﹑1% SDS﹑蛋白酶抑制剂)冰上放置20min，4℃ 15 000r/min离心20min，收集上清行定量分析。取30～40μg总蛋白行12% SDS-PAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗，室温培育3h，PBST洗膜，再分别加入抗鼠﹑抗兔的IgG室温培育1h，PBST洗膜，应用增强型ECL显色试剂盒于暗室曝光显影，实验均重复3次，Quantity One软件分析蛋白灰度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据以±s表示，组间比较采用Student's-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HBXIP在卵巢癌细胞中的表达 PCR检测结果显示，对照组中未见GAPDH基因表达，与对照组相比，卵巢癌细胞SKOV3中可检测到GAPDH表达(99.33±3.21)，差异有统计学意义(P＜0.001)。同时在卵巢癌细胞SKOV3中也检测到HBXIP基因表达(100.33±4.73)，而对照组中亦未检测到HBXIP基因的表达，差异有统计学意义(P＜0.001，图1)。

2.2 HBXIP对卵巢癌细胞增殖的作用 平板克隆形成实验结果显示，与对照组(68.2±4.8)相比，实验组卵巢细胞形成克隆的数目(117.0±9.1)明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01，图2)。采用MTT法分别检测实验组和对照组细胞的生存率，结果表明，转染48h后，实验组卵巢癌细胞A值(0.287±0.030)显著高于对照组(0.227±0.024)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 卵巢癌细胞中HBXIP基因的表达Fig.1 Expression of HBXIP gene in ovarian cancer cells

图2 克隆形成数目比较Fig.2 Comparison of number of formed clones

2.3 HBXIP对Skp2启动子活性的作用 荧光素酶报告基因分析结果显示，与对照组(171.09±5.81)相比，实验组Skp2启动子活性(411.55±15.91)显著增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.4 Western blott ing检测Skp2蛋白表达 采用Western blotting检测实验组和对照组细胞中HBXIP和Skp2蛋白的表达水平，结果显示，实验组卵巢癌细胞中HBXIP蛋白的灰度值(156.67±5.51)高于对照组(141.33±3.37)，差异有统计学意义(P＜0.05)。同时Skp2蛋白的灰度值(216.52±9.54)也随着HBXIP的过表达而升高，高于对照组中Skp2的表达(184.72±11.93)，差异有统计学意义(P＜0.05，图3)。

图3 HBXIP和Skp2蛋白的表达Fig.3 Expression of HBXIP and Skp2 protein in respective group

3 讨 论

HBXIP是一种细胞组成型表达蛋白，Melegari等[13]1998年首次于肝癌细胞株HepG2中克隆获得HBXIP，作为乙肝病毒编码的蛋白HBx的作用因子，并因此命名。HBXIP 基因定位于人染色体1p13.3，其开放阅读框基因编码全长173个氨基酸，分子量约为19kD。HBXIP与HBx的C末端结合后可下调HBx的活性，从而改变HBV的复制周期，同时抑制HBx对激活蛋白1(activating protein-1，AP-1)和内源性HBV启动子或增强子的反式激活作用，从而影响HBV的复制周期。研究发现HBXIP具有多种生物学功能，可与survivin和HBx形成复合物，并与pro-caspase-9结合，阻止其被凋亡酶激活因子Apaf-1招募，抑制线粒体或细胞色素C介导的凋亡途径[1]。HBXIP可以通过调节细胞周期蛋白，调节hTERT的表达水平，调控NF-κB信号途径而促进细胞增殖[2-4]。HBXIP还可以通过调节S100A4促进乳腺癌细胞的增殖和迁移[14]。这些结果提示HBXIP可通过多种途径和机制促进肿瘤的增殖和迁移。

为进一步阐明HBXIP对卵巢癌细胞的影响，本研究对HBXIP促进卵巢癌细胞的增殖作用以及Skp2在其中的机制进行了探讨。Skp2在多种恶性肿瘤中高表达，主要调节细胞从细胞周期的G1期进入到S期。Skp2的过表达促进了基因的复制和细胞增殖，与肿瘤的发生﹑浸润﹑转移及复发密切相关[15-17]。大量研究表明，Skp2的过表达与卵巢癌的发生密切相关，Inuzuka等[18]发现Skp2在SKOV3等细胞中表达。Shigemasa等[9]发现Skp2的表达对卵巢癌的进展和发展具有重要意义，Skp2的过度表达可作为卵巢癌患者独立的预后指标。Lu等[19]研究表明Skp2的表达水平与卵巢癌的临床分期和病理分级显著相关。最近研究表明，HBXIP可以结合Skp2启动子中的转录因子E2F1，激活Skp2启动子活性，同时上调Skp2的mRNA和蛋白表达，进而通过促进细胞周期进程来促进乳腺癌细胞的增殖[6]。但是，HBXIP在卵巢癌中是否也发挥同样的作用，有待于更深入的研究。

本研究首先通过PCR实验检测到HBXIP基因在卵巢癌细胞中表达，再通过平板克隆形成实验检测了卵巢癌SKOV3细胞的增殖能力，结果表明HBXIP可以促进卵巢癌细胞的增殖，并经MTT实验结果确认。荧光素酶报告基因检测结果显示，HBXIP的过表达具有促进Skp2启动子活性的作用。免疫印迹检测结果显示，在转染pCMV-HBXIP的卵巢癌细胞SKOV3中，HBXIP蛋白表达水平上升，表明pCMVHBXIP成功转染并表达，同时Skp2的蛋白水平也随着HBXIP的转染水平上升。提示卵巢癌中HBXIP可以激活Skp2启动子的活性，进而促进Skp2蛋白的表达。这与之前的研究结果相符合[6]，上述结果提示HBXIP可提高Skp2启动子活性和蛋白表达，进而通过Skp2发挥促进卵巢癌细胞增殖的作用。

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