体外上调淋巴细胞HO-1表达对CD4+CD25+Treg细胞分化的影响

陈瑞，张磊，宋少华，邹游，倪之嘉，郭闻渊

如何诱导宿主对移植物的免疫耐受一直是器官移植后的难题。最近研究表明，调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)作为T细胞的一个亚类，在免疫耐受中发挥着重要作用，如果Treg细胞功能发生紊乱，就可能导致自身免疫性疾病和免疫排斥[1]。血红素加氧酶-1(heme oxygenases-1，HO-1)是血红素分解的限速酶，通过抗炎﹑抗凋亡﹑抗增殖等在多种疾病中发挥作用[2]。有研究表明HO-1在器官移植中是一种保护性基因，移植后可发挥免疫耐受作用[3]，但机制尚不明确。本研究探讨了HO-1对淋巴细胞向CD4+CD25+Treg分化的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 清洁级C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重15～20g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。HO-1诱导剂钴原卟啉(Copp)﹑HO-1抑制剂锌原卟啉(Znpp)﹑二甲基亚砜(DMSO)﹑刀豆素A(ConA)﹑聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液购于Sigma公司，RPMI 1640﹑胎牛血清购于Gibco公司，抗小鼠CD25-FITC和CD4-PE流式荧光抗体购于Ebioscience公司，ELISA试剂盒购于BD公司，Western blotting试剂盒购于碧云天公司，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾脏淋巴细胞制备 无菌条件下取出C57BL/6小鼠脾脏，取70μm细胞滤网置于6cm培养皿中央，加入适量PBS溶液，将脾脏置于细胞滤网中，用2ml注射器针芯研磨，并以2ml或5ml注射器抽吸吹打成单细胞悬液，调整体积至6ml或8ml。取3ml或4ml分离液置于离心管中，将上述脾脏细胞悬液缓慢加于分离液上，形成清晰界面。细胞悬液与分层液的体积比以2:1～3:1为宜。将离心管置于水平离心机中，2000r/min﹑20℃离心20min，将加减速均调整为0。离心后从离心管底部到液面共分为4层，依次为红细胞和粒细胞层﹑分层液层﹑单个核细胞层﹑血浆层(含血小板和破碎细胞)。小心吸出界面处白膜层单个核细胞，置于另一离心管中，加入5倍量以上PBS液，充分混匀，1300r/min离心6min。弃上清，重复洗涤两遍，重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，调整细胞密度为1×107/ml，37℃﹑5%CO2培养箱培养。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测淋巴细胞HO-1和Foxp3 mRNA表达 收集离心重悬后细胞，按1×106/ml接种至6孔板，分为3组，即PBS组﹑Copp组和Znpp组，分别加入10μl PBS﹑Copp(50μmol/L)﹑Znpp(50μmol/L)处理12h，采用Trizol法提取细胞总mRNA，进行反转录和实时荧光定量PCR反应，引物由上海生工生物有限公司合成。使用QuantityOne软件进行定量分析，以GAPDH作为内参，计算HO-1和Foxp3的相对表达量。

1.2.3 Western blotting检测HO-1蛋白的表达 收集上述3组细胞，提取总蛋白。各取50μg总蛋白样品，行SDS-PAGE凝胶电泳(300mA，60min)，将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉常温下封闭2h，加入HO-1一抗(1:1000)和内参β-tubulin抗体(1:3000)过夜，加入二抗(1:1000)室温孵育2h，ECL发光。采用QuantityOne软件行定量分析。

1.2.4 流式细胞仪检测CD4+/CD25+T细胞比例收集各组小鼠脾脏淋巴细胞，用ConA孵育48h，调整每管细胞数为2×105个；分别加入抗小鼠CD25+-FITC荧光抗体﹑抗小鼠CD4+-PE荧光抗体及相应同型对照；冰上孵育30min，加入2% FBS-PBS液洗涤去除未结合抗体，1300r/min离心6min，洗两次；将细胞重悬至200μl，采用BD LSRⅡ流式细胞仪检测。

1.2.5 Th1﹑Th2类细胞因子表达的ELISA检测 收集各组细胞上清，采用ELISA法检测Th1类细胞因子IL-2和IFN-γ﹑Th2类细胞因子IL-10和TGF-β的表达水平。操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学处理 应用SAS 9.13软件进行统计分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 淋巴细胞HO-1 mRNA和蛋白表达情况 与PBS组比较，加入Copp诱导剂后，HO-1 mRNA和蛋白表达水平明显增加，而加入Znpp后，HO-1mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05，图1)。

2.2 流式细胞仪检测淋巴细胞向CD4+CD25+T细胞分化比例 与PBS组(3.5%)比较，Copp组向CD4+CD25+T细胞分化的比例(13.5%)明显增高(P＜0.05)，Znpp组(2.5%)则有所下降，差异均有统计学意义(P＜0.05，图2)。

2.3 Foxp3 mRNA表达检测 由图3可见，与PBS组相比，Znpp组Foxp3 mRNA表达下降，Copp组Foxp3mRNA表达增加(P＜0.05)。由于Foxp3是Treg的特异性标记[4]，所以可以确定上述CD4+CD25+T细胞是CD4+CD25+Treg细胞，提示HO-1可以促进T淋巴细胞向CD4+CD25+Treg的分化。

2.4 Th1/Th2类细胞因子表达的ELISA检测结果与PBS组比较，Copp组Th1类细胞因子IL-2和IFN-γ表达水平明显降低(P＜0.05)，Th2类细胞因子IL-10和TGF-β表达水平明显升高(P＜0.05)。与之相反，Znpp组的Th1类细胞因子表达水平明显上升，Th2类细胞因子表达水平明显降低(图4，P＜0.05)。

3 讨 论

HO-1是血红素分解的限速酶，具有抗炎﹑抗凋亡﹑抗增殖等作用[5]。目前研究发现HO-1是一种保护性基因，在自身免疫性疾病﹑器官移植中有抑制免疫反应的作用，可减轻移植后的慢性排斥反应，延长移植物生存时间[3]。有研究表明，在肝移植术后，HO-1可以减轻缺血再灌注损伤及移植物的免疫排斥反应，但这种保护作用尤其是在免疫耐受方面的作用机制仍然不明确[6-7]。在炎症性疾病中HO-1可通过促进巨噬细胞高表达Th2类细胞因子IL-10来发挥抗炎作用[8]，而IL-10是参与免疫耐受的重要的细胞因子。因此推测HO-1可能会通过调节Th1和Th2类细胞因子的平衡来发挥免疫耐受作用。

图1 HO-1 mRNA(A)和蛋白(B)表达情况Fig.1 HO-1 mRNA (A) and protein (B) expression

图2 各组细胞诱导分化为CD4+CD25+T细胞的比例Fig.2 The ratio of differentiated CD4+CD25+ T cells in each group

图3 各组细胞Foxp3 mRNA表达情况Fig.3 Foxp3 mRNA expression in each group

图4 细胞因子IL-2﹑IFN-γ﹑TGF-β﹑IL-10表达的ELISA检测结果Fig.4 Expression of IL-2, IFN-γ, TGF-β and IL-10 detected by ELISA

CD4+CD25+T细胞是CD4+T细胞的一个亚类，此细胞群高表达CD25+﹑CD4+和Foxp3。Foxp3是Treg分化和发挥功能的关键分子，被认为是Treg的特异性标记[9]。尽管Treg在T淋巴细胞中所占比例不大，但可抑制T细胞的自身免疫性反应，减轻由于后者引起的炎症性疾病，在免疫耐受中发挥着重要的作用[10-11]。研究显示，Treg可抑制细胞因子IL-2的表达，从而阻断免疫排斥反应的发生[12]。IL-10和TGF-β等抑炎细胞因子可诱导CD4+CD25+Treg的生成[13]。Th1和Th2细胞因子是两种参与不同免疫反应类型的细胞因子，Th1细胞因子IL-2和IFN-γ是促炎因子，可以促进免疫反应的发生，Th2类细胞因子IL-10和TGF-β是抑炎因子，主要在免疫耐受中起作用[14]。两种细胞因子互相平衡共同调节免疫反应，否则就会导致免疫功能的紊乱。自身免疫疾病和炎症反应使Th 1类细胞因子IL-2﹑IFN-γ表达增加，而Th2类细胞因子IL-10和TGF-β可以下调Th 1类细胞因子的表达[15-16]。

本研究结果显示，HO-1表达增加的细胞高表达Th2细胞因子，而低表达Th1类细胞因子，从而诱导小鼠脾脏淋巴细胞高表达Foxp3并向CD4+CD25+Treg分化，提示在器官移植中HO-1可能通过调节Th1/Th2的平衡诱导CD4+CD25+Treg的分化，从而发挥免疫耐受作用。

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