脓毒症大鼠小肠上皮PepT1的表达变化及其与Ghrelin的相关性研究

刘景全，马国光，石斌，娄晓丽，刘鸿翔，施凯，梁冬雨，万晟霞

脓毒症是ICU患者死亡的主要原因之一[1-2]。目前认为，小肠上皮短肽载体1(oligopeptide transporter，PepT1)对蛋白质分解产物短肽的转运是肠道吸收蛋白质的主要途径[3]，但在脓毒症复杂病理条件如内毒素﹑缺血﹑缺氧及炎性介质等多种因素影响下，小肠上皮PepT1的生物学变化仍不明确，相关研究甚少。新近发现的激素Ghrelin是一种内源性脑肠肽，已有研究表明，脓毒症时血清Ghrelin水平显著下降，给予外源性Ghrelin可显著改善脓毒症时的急性胃肠功能损伤[4]。但脓毒症时机体自身Ghrelin分泌水平是否影响小肠上皮PepT1的表达需进一步探讨。本研究采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)模型，探讨脓毒症时肠上皮PepT1表达的变化及其与Ghrelin水平的关系，以期为脓毒症肠道功能障碍的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 健康雄性SPF级SD大鼠48只，体重275～325g，由上海市第一人民医院实验动物中心提供，动物许可证号SYXK(沪)2009-0086。兔抗大鼠PepT1抗体(美国Santa Cruz公司)，β-actin抗体﹑HRP-抗兔IgG(美国CST公司)，Gly-Sar(美国Sigma公司)，FQ-PCR试剂盒(美国ABI公司)。

1.2 脓毒症模型制备 参照Rittirsch等[5]的CLP法进行脓毒症模型制备。大鼠麻醉后，无菌操作，腹正中切口2cm，于盲肠盲端2/3处结扎，用18G套管针将盲肠贯通，穿2个孔，挤出少许粪便，还纳腹腔，缝合腹壁切口。动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.3 动物分组及处理 48只大鼠按随机数字表法分为对照组(n=8)和脓毒症组(n=40)，脓毒症组又根据模型建立后4﹑8﹑12﹑16﹑20h时间点随机均分为5个亚组。对照组大鼠剖腹后仅分离盲肠，不结扎和穿孔；脓毒症组大鼠剖腹后行CLP。各组术后均给予生理盐水30ml/kg皮下注射。

1.4 标本采集与处理 分别于建模4﹑8﹑12﹑16﹑20h后活杀大鼠，留取静脉血4ml待测血清Ghrelin水平。以Treitz韧带远侧6cm处为起点，留取上段空肠约20cm，一部分测黏膜Ghrelin水平；一部分保存于4%甲醛溶液中，待行病理观察；一部分于4℃下制备小肠黏膜刷状缘囊泡(BBMV)，方法参照文献[6]，待测小肠上皮PepT1的表达及功能。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 小肠病理观察 取小肠组织，在多聚甲醛水溶液中固定，组织切片，HE染色，光镜下观察空肠黏膜病理学变化。

1.5.2 血清及肠黏膜Ghrelin水平检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清及肠黏膜Ghrelin水平，按试剂盒说明书步骤操作。

1.5.3 Real-time qPCR检测PepT1 mRNA表达 将制备好的BBMV按照Trizol说明书步骤提取细胞总RNA，经反转录得到cDNA。PepT1特异引物：正义链5'-GTATGTTCTGTTCGCCTCCTTG-3'，反义链5'-GGTGAATGCTGGACTTGGTATG-3'，产物长度228bp；内参GAPDH引物：正义链5'-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反义链5'-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'，产物长度181bp。采用Taqman Probe探针法，对目的基因和管家基因分别进行定量检测，通过GAPDH校准，分析各组样品中PepT1目的基因的相对表达量。

1.5.4 Western blotting检测PepT1蛋白表达 提取50μg BBMV总蛋白，上样于10%SDS-PAGE凝胶，电泳后转膜至硝基纤维素膜；加入兔抗大鼠PepT1抗体(1:1000)室温孵育2h，TBST漂洗3～5次，每次10min；加入HRP-抗兔IgG(1:5000)室温孵育1h，TBST液洗膜；加ECL发光底物，于暗室内压片。β-actin作为加样内参照，稀释鼠抗β-actin多克隆抗体(1:1500)作为一抗，稀释HRP标记的IgG(1:1500)作为二抗。Western blotting胶片经UltroscanXL(Pharmacia LKB)光密度仪扫描，根据面积和深浅计算蛋白条带的光密度(A)值(Quantity One Version4.4软件)。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行数据处理。所有连续变量通过正态性检验，呈正态分布的资料以±s表示，行多组间单因素方差分析(Oneway ANOVA)。多组间的两两比较，若方差齐用Dunnett-t检验，若方差不齐用Mann-Whitney U检验。相关性分析采用Pearson方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肠黏膜病理改变 对照组小肠黏膜结构无显著变化，小肠微绒毛排列整齐；脓毒症组(4﹑8﹑12﹑20h亚组)出现不同程度肠绒毛结构紊乱﹑短缩﹑脱落，黏膜水肿，炎性细胞浸润，毛细血管出血和溃疡形成(图1)。

2.2 各组PepT1 mRNA表达水平比较 Real-time qPCR检测结果显示，与对照组比较，脓毒症8﹑12﹑16﹑20h组小肠上皮PepT1 mRNA表达水平均明显下降(P＜0.05)，脓毒症各亚组小肠上皮PepT1mRNA表达水平之间无明显差异(P＞0.05，图2)。

2.3 各组PepT1蛋白表达水平比较 Western blotting检测结果显示，脓毒症12﹑16﹑20h组PepT1蛋白表达量较对照组及脓毒症4﹑8h组明显下降(P＜0.05，图3)。

2.4 血清及肠黏膜Ghrelin水平变化 血清和肠黏膜Ghrelin水平均在建模后4h达高峰，然后逐渐下降，脓毒症组各时间点与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05，图4)。

2.5 Ghrelin与PepT1蛋白表达的相关性 脓毒症时血清和肠黏膜Ghrelin水平均与肠上皮PepT1蛋白表达呈显著正相关(P＜0.001，图5)。

图1 大鼠小肠黏膜病理结构变化(HE ×100)Fig.1 Pathological changes of small intestinal mucosa of rats(HE ×100)

图2 脓毒症大鼠小肠上皮PepT1 mRNA表达变化Fig.2 PepT1 mRNA expression of rats with sepsis

图3 脓毒症大鼠肠上皮PepT1蛋白表达变化Fig.3 PepT1 protein expression of rats with sepsis

3 讨 论

脓毒症时可出现急性肠功能障碍，其特征是肠道吸收功能丧失，营养底物尤其是蛋白质﹑葡萄糖无法在肠道内转运吸收，机体不能维持蛋白质﹑液体﹑电解质和微量营养物质等的平衡，出现营养不良﹑免疫功能紊乱，并在此基础上引发或加重其他器官功能衰竭[7-8]。已有研究表明，小肠上皮PepT1对蛋白质分解产物短肽(二肽﹑三肽)的转运是肠道吸收蛋白质的主要途径，其表达数量及功能活性的高低直接影响机体的营养状况及疾病预后[9]。因此，研究脓毒症小肠上皮PepT1的生物学功能变化及调控，将为临床感染患者的营养支持模式及肠功能障碍改善提供理论依据。

CLP模型是目前国内外公认的脓毒症动物模型，能模拟腹腔脓肿发展到弥漫性腹膜炎﹑脓毒性休克和多器官功能障碍的临床过程[10]。在此过程中，机体处于严重应激状态，肠道组织细胞受到缺血﹑缺氧﹑内毒素和炎症的刺激，可能影响肠道上皮细胞内PepT1的正常表达及功能发挥。Shu等[11]研究表明，腹腔注射脂多糖(LPS)可降低大鼠空肠PepT1 mRNA和蛋白的表达，但此种变化并非PepT1特异的，地塞米松可通过抑制TNF-α和IL-1β释放抑制其表达下降。目前对脓毒症时小肠上皮PepT1表达及功能的改变认识仍不十分清楚。本研究结果显示，建模后8h大鼠小肠上皮PepT1 mRNA水平明显下降，建模后12h蛋白表达明显下降，在此后脓毒症的进程中，即建模后12～20h，检测到的PepT1 mRNA及蛋白表达水平持续维持在较低水平，提示脓毒症状况下，大鼠小肠上皮PepT1的基因转录及蛋白质表达均受到抑制，分析其可能机制为：①病理结果显示，脓毒症时小肠黏膜组织水肿，肠绒毛结构紊乱﹑短缩，肠黏膜组织屏障受到损伤，可能直接破坏肠上皮PepT1，致使其分布减少；②既往研究表明，脓毒症时由于大量炎性介质如TNF-α﹑IL-6等释放，抑制了肠上皮PepT1表达，引起小肠蛋白吸收障碍[12]。本研究证实了脓毒症时机体在基因和蛋白水平下调了小肠上皮PepT1的表达，致使机体对蛋白底物的转运吸收受到抑制。

图4 脓毒症大鼠血清及肠黏膜Ghrelin水平变化Fig.4 Ghrelin levels in serum and intestinal mucosas of rats with sepsis

图5 Ghrelin与PepT1蛋白表达的相关性分析Fig.5 Correlation analysis between the expression levels of ghrelin and PepT1 protein

研究发现肠功能衰竭在很大程度上也是内分泌功能尤其是胃肠激素﹑脑肠肽类激素分泌的衰竭。Ghrelin是1999年在大鼠胃黏膜及下丘脑中发现的一种脑肠肽激素，是生长激素释放激素受体(GHSR)的内源性配体，其受体广泛分布于胃肠道组织中，在调节胃肠功能方面起着重要作用，包括促进食欲﹑增加体重﹑促进胃肠动力等[13]。同时，脓毒症时给予外源性Ghrelin可显著增加大鼠小肠等的血管松弛度并抑制NF-λB通路，从而改善组织灌注及肠道黏膜通透性，抑制炎性介质产生，减轻肠壁水肿，减少细菌移位，延缓脓毒症向休克进展，在改善脓毒症肠功能障碍中发挥重要作用[14-15]。本研究结果显示，脓毒症时血清和肠黏膜Ghrelin水平在建模后4h达高峰，随着脓毒症进展，胃肠道功能障碍加重，出现胃肠分泌功能障碍，Ghrelin水平显著下降，这与Das[4]的研究结果一致。我们推测，随着Ghrelin分泌减少，对肠道的自我保护作用随之减弱，续贯出现PepT1蛋白破坏及表达下降。进一步分析显示，血清和肠黏膜Ghrelin水平与肠上皮PepT1蛋白表达存在显著正相关(r=0.792，r=0.756，P＜0.001)，提示其为保护性作用，也间接说明Ghrelin在机体摄食和蛋白吸收中发挥重要作用。

上述结果显示，脓毒症时肠上皮PepT1蛋白表达显著下降，Ghrelin分泌水平与PepT1蛋白表达呈正相关，具有保护性作用，对临床脓毒症严重感染患者的救治及营养支持提供了理论支持。后续研究将进一步探讨外源性Ghrelin对脓毒症肠上皮PepT1的调控作用及相关机制。

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