元素指纹图谱在藿香正气制剂质量评价中的应用

刘征辉，陈秋生，3，叶挺祥，赵洪芝，郭永泽，3，程 奕，3*

（1.天津海世达检测技术有限公司，天津 300381；2.天津市现代中药质量检验中心，天津 300381；3.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381）

藿香正气最早记载于北宋《太平惠民和剂局方》，距今已有千年历史，最初藿香正气只是散剂，随着现代中药制剂技术的进步，逐渐发展为多种剂型，藿香正气水是其常用的一种，由苍术、厚朴、白芷、甘草等十味中药组成，具有解表化湿、理气和中之功效，用于外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的感冒，症见头痛昏重、胸膈痞闷、脘腹胀痛、呕吐泄泻；胃肠型感冒见上述症候者［1］。

电感耦合等离子体质谱技术是上个世纪80年代发展起来的无机元素和同位素分析测试技术，它以独特的接口技术将电感耦合等离子体的高温电离特性与质谱计的灵敏快速扫描的优点相结合而形成一种高灵敏度的分析技术。该技术具有精密度高；速度快，可在几分钟内完成几十个元素的定量测定；谱线简单，干扰相对于光谱技术要少；线性范围可达7～9个数量级；样品的制备和引入相对于其他质谱技术简单；既可用于元素分析，还可进行同位素组成的快速测定［2-5］。本实验采取微波消解进行样品前处理，用ICP-MS同时测定藿香正气制剂中的5种重金属元素和9种其它微量元素量，采用化学计量学的手段对结果进行数据分析，旨在探索不同厂家生产的藿香正气制剂无机元素分布的规律［6-14］，并从无机层面为中药质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 Agilent 7500a电感耦合等离子体质谱仪 (ICP-MS):美国Agilent公司；MARS高通量密闭微波消解系统:美国CEM公司。玻璃器皿等用具经10%硝酸浸泡24 h后，用超纯水洗净。国家标准物质茶树叶 (GBW08513):中国科学院生态环境研究中心；超纯水由二次去离子水经Milli-Q装置 (电阻率≥18 MΩ)处理而得。硝酸 (优级纯，MOS级):天津市风船化学试剂科技有限公司。

多元素混合贮备液 (美国 Agilent公司，PN 5183-4688)。内标溶液:1.0 mg/L Y、Sc、In、Ge、Bi混合内标贮备液 (美国 Agilent公司，PN 5183-4680)。调谐液:10 μg/L U、Y、Ce、T1、Co(美国Agilent公司，PN 5184-3566)。藿香正气样品为市售，见表1。

表1 藿香正气制剂样品信息Tab.1 Information of Huoxiang Zhengqi Preparation samples

1.2 方法

1.2.1 混合标准溶液的配制 由多元素贮备液，用5%硝酸稀释而成。系列标准溶液质量浓度为0、5、10、20、50 ng/mL。

1.2.2 样品处理 针对液体制剂与固体制剂，分别采用了不同的前处理方法。

精密称定藿香正气水10 g于消解管中，置电热板上加热使其挥发乙醇，浓缩至3 mL左右，加硝酸5 mL，加盖，预消解过夜。再置电热板上120℃消解3h，待消解完全并冷却后，赶酸至1.0 mL左右，使用超纯水用重量法定质量至25 g。

精密称定藿香正气软胶囊 (片、滴丸)约0.5 g于消解管中，加硝酸5 mL，加盖，预消解过夜。再置电热板上120℃消解6 h，待消解完全并冷却后，110℃赶酸至1.0 mL，使用超纯水用重量法定质量至25 g。

每个样品平行2份，以计算测定结果的平均值和标准偏差。平行做11份空白。标准物质茶树叶(GBW08513)，处理方法与样品处理相同。

1.3 方法学考察

1.3.1 测定条件的优化 对RF功率、载气流速、积分时间等参数进行优化，提高了离子化效率、降低了干扰。优化条件见表2。此外，通过在线加入内标元素，监测信号的变动情况，有效克服仪器信号的漂移，在选择各个元素内标时，使用虚拟内标(VIS，Virtual Internal Standard)进行内标修正，可以提高定量的准确性。

表2 仪器工作参数Tab.2 Instrument parameters

1.3.2 线性范围 在0～50 μg/L质量浓度范围内，各元素的分析信号值与质量浓度均呈良好线性关系，见表3。

表3 各元素检出限与回归方程结果Tab.3 Results of LODs and regression equations

1.3.3 方法检出限 用11份平行空白液的测定结果，以3倍标准偏差计算各元素的检出限，见表3。

1.3.4 方法准确度 用标准物质茶树叶(GBW08513)对分析方法的准确度进行验证，测量值与标准值在允许误差范围内。

2 结果与分析

2.1 样品测定 按实验方法分别测定了27批次不同厂家的藿香正气水 (软胶囊、滴丸)各元素量，结果见表4、表5。

表4 不同藿香正气产品中重金属量Tab.4 Analysis results of heavy metal elements in different products of Huoxiang Zhengqi Preparations

2.2 藿香正气元素指纹图谱的化学模式识别研究 为了更加直观的评价无机元素对藿香正气制剂质量的影响，根据无机元素指纹图谱5种重金属元素和9种其它微量元素的量进行化学模式识别分析。

2.2.1 聚类分析 首先应用SPSS数据处理软件对藿香正气水进行聚类分析。利用欧氏距离(Euclidean)作为样品的测度，采用离差平方和法(Ward's Method)进行聚类，得到聚类谱系图。由聚类结果图可以看出不同厂家之间的差异，但相同厂家的不同批次产品也存在差异。

图1、图2分别为5种重金属元素和9种其它微量元素的聚类结果图。两类不用元素的聚类结果都将27个样本分成了两大类，1～18号为水剂归为到类，其它固体制剂为另一类，但根据重金属元素的聚类结果显示26、27号滴丸制剂也被分在水剂这一类，提示滴丸制剂可能在工艺上与其它固体制剂的不同。

表5 不同藿香正气产品中其它元素的量Tab.5 Analysis results of other elements in different products of Huoxiang Zhengqi Preparations

图1 藿香正气5种重金属元素量分析聚类谱系图Fig.1 Hierarchical cluster analysis dendrogram of 5 heavy metal elements of Huoxiang Zhengqi Preparations

图2 藿香正气9种微量元素分析量聚类谱系图Fig.2 Hierarchical cluster analysis dendrogram of 9 other elemtents of Huexiang Zhangqi preparations

2.2.2 主成分分析 通过对27批次的藿香正气制剂元素指纹图谱进行主成分分析，得到了5种重金属元素的主成分得分图 (见图3)和9种其它微量元素的主成分得分图 (见图4)，明显看出，其中1～18号距离相当紧密，明显聚为一类，19～25号固体制剂分布在图的上部分，26、27号滴丸样品在液体制剂和其它固体制剂之间。这与聚类分析的结果相一致。

图3 5种重金属元素测定结果的主成分得分图Fig.3 Principal component analysis(PCA)score figure of 5 heavy metal elements

图4 9种微量元素测定结果的主成分得分图Fig.4 Principal component analysis(PCA)score figure of 9 other elements

经计算得到主成分的模型为:

上式中，F1，F2分别表示两个主成分，XCu，XAs，XCd，XHg，XPb分别表示各个元素的量数据。而两个主成分中，F1是特征值最大的，即是“信息最多”的指标，而第一主成分中各个元素的系数基本相同，说明Cu、As、Cd、Hg、Pb各个元素的对分类的贡献基本相同。

图4为9种其它微量元素的主成分分析结果图。按主成分个数提取原则为累计方差贡献率大于85%的n个主成分，结果如下:第一主成分的特征值λ1=5.398，方差贡献率为59.98%；第二主成分的特征值:λ2=1.381，方差贡献率为15.343%；λ3=0.983，方差贡献率为10.92%；3个主成分的累计方差贡献率为86.24%，选取前3个得分矢量来作图。图中每个点对应1个样本，从图可知，此27个样本可分为两类，与聚类分析结果一致，即可印证聚类结果图。

将每一个载荷量表示主成分与对应变量的相关系数除以主成分相对应的特征值开平方根便得到两个主成分中每个指标所对应的系数，经计算可得主成分的模型为:

上式中，F1，F2，F3分别表示两个主成分，XNa，XMg，XK，XCa，XMn，XFe，XNi，XZn，XSe分别表示各个元素的量经标准化后的数据。而两个主成分中，F1是特征值最大的，即是“信息最多”的指标，而第一主成分中系数差别不大，XK，XCa的系数大于0.4，XFe的系数小于0.1，其它元素均差别不大，说明除Fe元素贡献较小外，各个元素对分类的贡献差别并不大。

3 讨论

3.1 应用ICP-MS对不同产家不同剂型的藿香正气产品进行了5种重金属元素和9种其它微量元素的测定，并应用化学模式识别方法进行聚类分析和主成分分析，不同厂家的不同藿香正气剂型均得到了很好的聚类结果，为建立基于无机元素分析的藿香正气质量评价方法提供可能。

3.2 微量元素与活性分子在人体内起着相互协同、互相补充、互相渗透、互相制约的作用，并参与体内各种生化反应，促进机体自身调节，达到新的阴阳平衡，从而达到治疗疾病的目的。本实验还选取了9种其它元素进行测定，包括了人体必须的元素(Na、Mg、K、Ca)，微量元素 (Mn、Ni、Fe、Zn、Se)。从测定结果中发现滴丸中的 Cu、As、Cd、Hg、Pb元素的量普遍较低，与藿香正气水中的量结果比较接近，导致滴丸剂型与水剂分类较为接近，但由于所收集滴丸样本较少，此结论还待进一步研究确证。

3.3 通过上述研究发现，藿香正气水不同厂家、不同剂型之间在化学物质层面存在着很大差异，我们在关注有机化合物对药品质量影响的同时，应注意无机元素的量对药效的影响，在药品的质量控制中，探讨有机物、无机物的双层面控制保证药品疗效。因此，需要在现有的中药质量控制模式上建立起较为全面的中药质量控制与评价方法。

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