药用野生稻体细胞杂交后代对条纹叶枯病的抗性鉴定

董岩 ，钱长根 ，张维林 ，马荣荣 ，羊健 ，张恒木 ，严成其 ，陈剑平

1.南京农业大学 植物保护学院，江苏 南京 210095；2.嘉兴职业技术学院，浙江 嘉兴 314036；3.浙江师范大学 生化学院，浙江 金华 321000；4.浙江省宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040；5.浙江省农业科学院 省部共建国家重点实验室培育基地，农业部植物保护与生物技术重点实验室，浙江省植物病毒重点实验室，浙江 杭州310021

水稻条纹叶枯病（rice stripe disease）是由水稻条纹病毒（rice stripe virus，RSV）引起的一种危害严重的水稻病毒病，通过灰飞虱（Laodelphax striatel⁃lus Fallén）刺吸以持久方式传播[1-2]，具有暴发性、迁移性和间歇性等特性，属可防难治的病毒病害，一旦发生难以控制[3]。早期发病株的叶心呈现黄色条纹，叶片柔软下垂，常伴有植株矮化、分蘖减少等特征；在水稻分蘖盛期前发病的植株叶片卷曲呈捻转状；后期发病叶片上呈现黄色条纹，抽穗不良或畸形，严重影响水稻产量与品质[4-5]。由于感病粳稻品种大面积推广，20世纪90年代曾在江苏发生，随后蔓延到整个长江中下游的各稻区，并迅速成为该稻区水稻生产中的主要病害之一[6]。2004年在江苏省的42个县都有条纹叶枯病发生，获病面积达157万公顷，占水稻栽培面积的79%，绝收面积达5200公顷，给水稻生产带来巨大损失[7]。

野生稻是一种重要的天然基因库，携带对各种病虫害和非生物逆境的抗（耐）性基因[8-10]。我们前期的研究结果表明，药用野生稻对灰飞虱具有很强的抗性和排驱性。由于分属不同的种，药用野生稻（CC染色体组，2n=24）与栽培稻（AA染色体组，2n=24）难以以常规杂交方法获得后代。课题组采用原生质体不对称体细胞杂交将药用野生稻高抗灰飞虱基因转移到栽培稻。研究表明，在许多水稻品种中，抗灰飞虱特性与抗条纹叶枯病特性密切相关，有些品种的这2种抗性相关系数高达99%以上，说明这些水稻品种的抗灰飞虱基因与抗条纹病毒基因可能是连锁的[11]。研究发现[12-14]，预防条纹叶枯病最经济有效且符合农业可持续绿色发展要求的方法是筛选抗病资源，培育和推广抗病品种。为此，本实验的目的旨在从药用野生稻后代中筛选抗条纹叶枯病材料，为水稻条纹叶枯病抗病品种的选育和推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

药用野生稻与栽培稻02428通过体细胞杂交，获得149份杂交后代，并从中筛选出1个对条纹叶枯病表现高抗的水稻材料Pf5-5；Pf5-5与9311杂交获得110份F1个体，实验中随机选取34份F1个体作为供试材料。武育粳3号为感病对照，孙戴珍[1]等已经报道的具有抗条纹叶枯病特性的Kasalath为抗病对照品种。

带毒灰飞虱由江苏省农业科学院提供，在感病材料武育粳3号上饲养。参照周益军[15]等的方法饲养，用ELISA[16]技术检测灰飞虱带毒情况，筛选带毒率大于50%的群体定为传毒群体。

1.2 苗期接毒鉴定

将亲本F1及抗感对照播种于2000 mL烧杯中，每杯40株稻苗，每份材料播种4份，保证有足够的供试株数。待水稻苗长至三叶期时接毒，放虫前剔除病弱苗，保证有30株生长一致的稻苗，盖好纱布用于接虫鉴定。抗性级别参照Washio[17]等的方法：0级，无症状；1级，病叶不卷曲，有轻微黄绿色斑驳，植株生长正常；2级，病叶上有黄绿色或黄白色条斑，病叶卷曲或轻微卷曲，植株生长基本正常；3级，叶片严重失绿，病叶卷曲呈捻转状，少数叶片黄化枯萎；4级，多数叶片卷曲呈捻转状，病叶黄化枯死，植株呈假枯心状或整株枯死。根据周彤[15]对水稻条纹叶枯病鉴定方法的研究，设定接虫时间为48 h，接种虫量为4头/株，虫龄为2～4龄。为确保供试稻苗均匀获毒，每天早、中、晚各手动赶虫1次。接虫48 h后清除所有灰飞虱，并移栽到网室的田块内。接虫7 d后调查病害情况，每隔7 d调查一次，共调查4次。

0～1级记为抗病，2～4级记为发病，计算发病率，然后根据发病率进行抗性评价。抗性评价参照周益军[15]等制定的标准并略加改动：免疫（I），发病率为0；高抗（HR），发病率0～5%；抗病（R），发病率5.1%～15%；中抗（MR），发病率15.1%～30%；感病（S），发病率30.1%～50%；高感（HS），发病率大于50.1%。

1.3 ELISA技术检测水稻感病率

稻苗三叶期接毒，接毒方法同上，接毒48 h后驱赶全部灰飞虱，7 d后采集样品用于ELISA[16]，检测供试水稻品种感病率，鉴定株数为70株。

感病率（%）=感病株数/鉴定株数×100%

2 结果

2.1 亲本在田间的抗感表现

如表1所示，感病对照武育粳3号平均发病率为67.5%，同时在ELISA检测中，武育粳3号的感病率为78.6%，表现为高感；抗病对照Kasalath的平均发病率为2.1%，感病率为5.7%，表现为高抗，表明本次试验结果可靠。药用野生稻体细胞杂交后代Pf5-5的平均发病率为3.2%，感病率为4.2%，表现高抗；栽培稻9311的平均发病率为63.6%，感病率为68.6%，表现高感。

2.2 F1个体表型鉴定

如表2所示，34份F1个体中，Y35、Y37、Y39、Y42和Y45的发病率分别为4.6%、2.9%、2.7%、2.2%和4.2%，表现高抗；其余29份材料的发病率为5.6%～14.4%，表现抗条纹叶枯病。

表1 亲本（9311/Pf5-5）抗条纹叶枯病的田间抗性表现

表2 F1水稻材料对条纹叶枯病的抗性评价

2.3 ELISA检测F1个体的感病率

感病率检测实验结果表明，Y35、Y37、Y39、Y42和Y45的感病率分别为7.1%、5.7%、5.7%、5.7%和4.3%。Y45的感病率高于抗病对照Kasalath，Y37、Y39和Y42的感病率与Kasalath相同，表明这4个材料高抗水稻条纹叶枯病。Y35的感病率略低于Kasalath，表明抗水稻条纹叶枯病。Y6、Y13、Y14、Y51、Y56、Y62和Y75的感病率为11.4%～14.3%，表现抗条纹叶枯病。剩余22份材料的感病率为15.7%～30.0%，表现对条纹叶枯病中抗。见表3。

表3 F1个体感病率检测

3 讨论

Y37、Y39、Y42和Y45的表型鉴定试验和检测感病率试验结果一致，都表现为高抗条纹叶枯病。Y6、Y13、Y14、Y51、Y56、Y62和Y75的表型鉴定试验和检测感病率试验结果一致，都表现抗条纹叶枯病

Y35在表型评价中的抗性级别为高抗，而在ELISA检测带毒率试验中表现抗条纹叶枯病；其余22份水稻材料在ELISA检测带毒率试验中表现对条纹叶枯病中抗，而在表型评价中的抗性级别为抗条纹叶枯病。比较2项试验数据，发现每个材料的感病率都略高于它们的发病率，分析其原因可能是在调查表型时病症表现不明显，或者这些材料对水稻条纹叶枯病病毒的忍耐性。如果表型病害级别和材料的感病率不一致，我们以较严重的得病指标作为抗病筛选的标准，这样筛选出的结果可靠性高。所以将Y35作为抗性材料，其余22份水稻材料确定为中抗材料。

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