敲低GATA1慢病毒表达载体的构建及敲低效果检测

张亚楠，刘婕，林娅红，周蕾，丁丽华，叶棋浓

军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850

GATA1是转录因子GATA蛋白家族成员，1991年被首次发现报道。GATA1可以与［T/A（GATA）A/G］序列结构特异结合，随后GATA2～GATA6逐一被报道，形成GATA家族。GATA1是造血系统特有的转录因子，为正常红细胞发育所必需，不仅存在于红系细胞中，在巨核细胞系和肥大细胞系中也有很高的含量[1-2]。GATA1调控红细胞的分化和成熟，在巨核细胞分化发育过程中具有多功能性，可影响细胞生长发育和成熟。同时，GATA1的点突变可导致白血病的发生，GATA1与伴有严重贫血的多发性骨髓瘤也有密切关系[3]。由此可见，GATA1在造血细胞系中有很高的含量，与很多血液系统疾病的发生有着密切的联系，也与人类身体健康息息相关[4]。我们的研究表明，GATA1在除了造血系统和免疫系统细胞中表达外，在其他类型的细胞中（如本文的人胚肾细胞）也有表达，提示GATA1在实体肿瘤中也有作用。由于GATA1在实体瘤中的作用只在乳腺癌中有所报道，因此深入研究GATA1在实体肿瘤中的功能及其分子机制具有十分重要的意义。

我们用构建慢病毒载体的小发夹RNA（shRNA）技术抑制GATA1的表达，与普通转染方法相比能获得更高的感染效率，以便为GATA1的后续研究奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾293T细胞由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞、转染试剂LipofectAMINE 2000、TRIzol均购自Invitrogen公司；DMEM培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；慢病毒表达载体购自SBI公司，包含pSIH1-H1-Puro载体和pPack Packaging Plasmid Mix载体；限制性内切酶、DNA连接酶、反转录酶、实时定量PCR试剂均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒为Promega公司产品；兔抗人GATA1抗体购自Abcam公司；兔抗人GAPDH和辣根过氧化物酶偶联的IgG均购自Santa Cruz公司；引物由北京赛百盛生物有限公司合成；质粒测序分析由北京博迈德科技发展有限公司完成；实时定量PCR仪为ABI PRISM 7000型。

1.2 shRNA慢病毒载体的构建

根据shRNA靶序列筛选设计原则，结合人GATA1的基因序列和网站分析，选择确定一条特异性shRNA靶序列。利用NCBI数据库对确定的靶序列进行Blast分析，证明与其他已知基因没有同源性，然后设计合成寡核苷酸的正义链和反义链进行退火处理，即先将其分别溶于双蒸水中，等摩尔数混合后95℃加热5 min，自然降温至37℃，形成双链的寡核苷酸。将退火的shRNA序列插入经酶切的pSIH1-H1-Puro载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆测序验证。GATA1 shRNA的上游序列为5'-TAGTG CTTATGGGGGCCCTGACTTT-3'，下游序列为5'-AA AGTCAGGGCCCCCATAAGCACTA-3'。

1.3 质粒瞬时转染293T细胞

细胞用含10%新生牛血清和双抗的DMEM培养基培养，用不含双抗、含10%胎牛血清的DMEM培养基将人胚肾293T细胞接种于12孔板中，接种量以转染时细胞密度达到80%为宜，培养24 h后进行转染。将总量2 μg的质粒与50 μL无血清无抗生素的DMEM培养基混合，再将1 μL Vigorous与50 μL无血清无抗生素的DMEM培养基混合，然后将上述2种溶液轻轻混合，室温放置15 min，加入12孔板中，37℃、5%CO2常规培养48 h后收获细胞。

1.4 Western印迹

人胚肾293T细胞转染48 h后收集细胞，加入SDS-PAGE加样缓冲液，煮沸15 min，离心后取上清液进行SDS-PAGE，电泳结束后转移至硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，然后用以5%脱脂奶粉稀释的抗GATA1多克隆抗体室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次6 min；加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次6 min；用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.5 细胞RNA提取和RT-PCR检测

转染48 h后收集人胚肾293T细胞，加入TRIzol提取细胞总RNA，取2 μg进行反转录，得到cDNA第一链，以之为模板，用实时定量PCR仪分别扩增GATA1 cDNA［引物为 Forward（5'-TGGAGACTTTG AAGACAGAGCGGCTGAG-3'）和 Reverse（5'-GAAG CTTGGGAGAGGAATAGGCTGCTGA-3'）］和 β-actin内参基因［引物为Forward（5'-ATCACCATTGGCA ATGAGCG-3'）和 Reverse（5'-TTGAAGGTAGTTTC GTGGAT-3'）］，并收集荧光信号，用 2-ΔΔCt方法进行基因相对表达分析。

2 结果

2.1 GATA1 siRNA慢病毒载体的构建

将合成的2条引物进行退火处理后，将退火产物和2条引物一起进行琼脂糖凝胶电泳（图1），结果显示退火产物的条带水平位置位于2条引物的上方，证明退火成功。转化后挑取GATA1 siRNA慢病毒载体克隆，DNA测序结果显示GATA1 siRNA序列已插入pSIH1-H1-Puro载体，序列与预期完全一致（图2），证明GATA1 siRNA表达载体构建成功。

2.2 GATA1 siRNA对GATA1基因表达的影响

图1 GATA1 siRNA退火结果

图2 GATA1 siRNA慢病毒载体的测序结果

在有内源性GATA1表达的293T细胞中，分别转染GATA1 siRNA及对照siRNA，48 h后收集蛋白，用GATA1抗体进行Western印迹（图3）。结果表明，与对照组相比，GATA1 siRNA能明显抑制内源性GATA1的表达，而同时用GAPDH抗体检测并没有明显的改变。由此可见，所设计的GATA1 siRNA能够有效降低GATA1基因的表达。

2.3 GATA1 siRNA对GATA1基因转录水平的影响

在有内源性GATA1表达的293T细胞中，分别转染GATA1 siRNA及对照siRNA，48 h后收取细胞提取细胞总RNA，利用RT-PCR鉴定GATA1 siRNA的抑制效果（图4）。RT-PCR结果表明，与对照组相比，GATA1 siRNA转染组的mRNA水平显著降低，说明构建的GATA1 siRNA能够有效抑制293T细胞GATA1基因的转录水平。

图3 Western印迹检测GATA1 siRNA的敲低效果

图4 RT-PCR检测GATA1 siRNA的敲低效果

3 讨论

RNA干扰（RNAi）是近年发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。慢病毒载体是源于人免疫缺陷病毒1（HIV-1）的一种病毒载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。携带外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中的表达。将慢病毒载体作为siRNA的携带者，不但具备特异性的使基因表达沉默的能力，还能充分发挥自身所具备的优势。实验证实，我们所构建的GATA1 siRNA慢病毒表达载体具有显著的干扰效果。

转录因子GATA1在正常红细胞增殖、分化过程中起重要的生物学作用，且控制着巨核细胞、肥大细胞核嗜酸性细胞的分化。GATA1可以和许多生物大分子相互作用[5]，在血小板减少症、多发性骨髓瘤、白血病等疾病中发挥重要的生物学效应[6-7]。实验证实，我们构建的GATA1 siRNA慢病毒表达载体可以降低GATA1基因的表达水平，同时也能有效抑制GATA1的转录水平。GATA1作为一个潜在的癌基因，在诸多血液疾病中发挥重要作用，可能成为肿瘤基因治疗的靶标[8-9]。但是，GATA1在实体肿瘤中的作用还很不清楚。综上，GATA1 siRNA慢病毒载体的成功构建，为进一步研究GATA1多方面的功能打下了坚实的基础。

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