磁性纳米颗粒作为载体在基因转染中的研究进展

卢艳敏

衡水学院 生命科学系，河北 衡水 053000

在进行基因治疗及基因功能研究时，外源基因能否有效地导入受体细胞，并进行高效、稳定的表达，在很大程度上取决于所采用的载体。理想的基因载体应该制备简单，重复性好，转染效率高，具有良好的靶向性、较高的安全性，无免疫原性，能将目的基因整合至受体细胞的染色体上，实现外源基因的稳定表达。传统的基因传递系统分为病毒载体介导系统和非病毒载体介导系统[1-2]。病毒载体主要包括逆转录病毒载体[3]、腺病毒载体[4]、腺相关病毒载体、慢病毒载体[5-7]、单纯疱疹病毒载体[8-9]。病毒载体是基因治疗中较为常用的DNA运载工具[10]，其运载效率高达90%以上，但该系统具有免疫原性和病毒性，装载容量有限，组装难度大，花费高，因此限制了病毒载体的广泛使用。非病毒载体主要包括脂质体[11]、阳离子多聚体[11-16]和纳米颗粒[10,17-18]。磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNP）具有很强的结合、浓缩与保护DNA的作用，较高的安全性和低的免疫原性；具有超顺磁性，在外加磁场的作用下可实现基因的靶向性运输，提高外源基因的转染效率。在磁性纳米颗粒表面修饰生物材料，可以提高磁性纳米颗粒的生物相容性。磁性纳米颗粒有望在寄主范围、基因装载容量、转染效率等方面克服现有基因载体的局限性，是一种极具应用前景的非病毒载体。由于磁性纳米颗粒的独特性质，使得其作为基因载体在基因治疗中的应用得到迅速发展。

1 磁性纳米颗粒的特点、种类及结构

磁性纳米颗粒因其处于纳米级，除了具有其他纳米材料的特性外，还具有特殊的磁性能力即超顺磁性。当具有磁性的颗粒小于某一临界值时，外场产生的磁取向力太小而不足以抵抗热骚动的干扰，导致其磁化性质与顺磁体相似，称作超顺磁性。当有外加磁场存在时，表现出较强的磁性，当撤去外加磁场时磁性随之消失，不会产生剩磁。

磁性纳米颗粒一般为核-壳式结构，由磁性材料和提供活性功能基团的材料组成。磁性材料主要是纳米级的铁、镍、钴等金属及其氧化物，其中应用最多的是Fe3O4。提供活性功能基团的材料包括天然生物大分子材料和合成的高分子材料两大类[19]，天然生物大分子材料主要有葡聚糖、淀粉、蛋白质等；合成的高分子材料主要有聚乙二醇、聚乙烯醇、聚N-异丙基丙烯酰胺及其共聚物，要求其具有良好的生物兼容性，无毒性，并具备一定的机械强度和稳定性。磁性纳米颗粒一般有3种包裹方式：核-壳结构，核为金属氧化物，壳层为高分子材料；壳-核结构，核为高分子材料，磁性纳米材料包裹到外面；壳-核-壳结构，外层和内层均为高分子材料，磁性纳米材料位于2层高分子材料中间。磁性纳米颗粒的制备方法有多种，可分为物理法和化学法，主要有共沉淀法[20]、水热法[21]、微乳液法[22]、溶胶-凝胶法[23]、模板法[24]等，每种方法各有优缺点，应根据需求选择适当的方法。

2 磁性纳米基因载体的特点

作为基因载体的磁性纳米颗粒是由含有磁性或可以被磁化的金属如铁、钴、镍及其金属氧化物等材料制备而成的，通过共聚、表面改性等赋予其表面多种功能基团（如-OH、-COOH、-CHO、-NH2等），便于偶联DNA等遗传物质形成磁性纳米颗粒/DNA复合物，在外加磁场驱动作用下将携带基因的磁性纳米颗粒定位富集于细胞表面或定向输送到靶部位，增加了磁性纳米颗粒/基因复合物与靶部位的接触时间和接触量，提高了基因载体的靶向性和基因转染效率[25-26]。磁性纳米颗粒介导的体外基因传递是将磁性纳米颗粒/DNA复合物加入细胞培养物内，在细胞培养物的下面放置磁铁，加速了携带基因的磁性纳米颗粒的沉降，提高了转染速度和效率[27]。磁性纳米颗粒/基因复合物在外加磁场作用下首先吸附到细胞表面，随后进入细胞，在转染1～2 h后形成核周环复合物，其后数小时被转运至核内。Sauer等将磁性纳米颗粒/基因复合物在细胞内的运动分为3个时期：第一时期，复合物向细胞膜移动，随后进入细胞，此过程为肌动蛋白细胞骨架介导的运动；第二时期，复合物被运送到细胞的限制组件中；第三时期，复合物通过微管被运送到细胞核内[28]。磁性纳米颗粒可以介导体内基因的传递，携带治疗基因的磁性纳米颗粒通过静脉注射入体内，将磁铁置于靶部位，在外加磁场的作用下，磁性纳米颗粒携带的基因通过血管进入靶组织，发挥治疗功能[29]。

目前磁性纳米颗粒中作为基因载体应用较多的是氧化铁磁性纳米颗粒，磁性氧化铁纳米颗粒的制作工艺简单，粒径容易控制，具有比表面积效应，易于结合DNA，具有超顺磁性，在外加磁场的作用下具有较强的磁性，可以实现靶向性运输，撤去磁场则磁性很快消失，不会被永久磁化。氧化铁对细胞无毒，不易被酶消化降解，在磁性氧化铁的表面可很容易地包埋生物高分子，使其具有很高的生物相容性，同时便于与外源基因结合。

研究发现，氧化铁纳米颗粒在酸性条件下Zeta电位为正，可以与DNA结合；而在中性和碱性条件下Zeta电位为中性或负性，不利于DNA的结合，不能满足生理pH条件下的基因转移。因此，为了提高DNA的装载量，使用带正电荷的高分子材料对氧化铁进行表面修饰[30]。唐秋莎等采用化学共沉淀法制备了磁性纳米颗粒，然后用聚乙烯亚胺（PEI）对合成的纳米颗粒进行表面修饰，发现PEI修饰的磁性纳米粒子能与DNA结合，并可有效地保护DNA免受DNaseⅠ的消化[31]。谭泽明以偶联剂Y-氨丙基三乙氧基硅烷［NH2C3H6Si（OC2H5）3］对合成的 Fe3O4磁性纳米颗粒进行表面修饰，通过磁性纳米颗粒与DNA的结合实验，磁性纳米颗粒/DNA复合物的DNaseⅠ和血清消化实验结果表明Fe3O4磁性纳米颗粒具有结合及保护DNA的能力，MTT实验结果显示其对细胞无明显毒性[32]。Xiang等用多聚赖氨酸修饰氧化铁纳米颗粒，凝胶阻滞实验和DNA共沉淀实验表明修饰过的氧化铁在生理pH条件下可与DNA结合，且随着纳米颗粒的增加，对DNA的结合力越来越强，并且氧化铁纳米颗粒与DNA的结合力可以保护DNA免受酶的降解，MTT实验结果显示多聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒对细胞的毒性作用很小[30]。

磁性纳米颗粒与DNA通过静电作用吸引结合，这种非特异性相互作用使纳米颗粒与DNA形成紧密的复合物，产生空间位阻效应，阻止DNaseⅠ及Mg2+与DNA接触，使DNaseⅠ不能发挥消化活性[33]，因此磁性纳米颗粒具有很好的酶切保护效果。He等认为，由于纳米颗粒的尺寸效应使得DNA易于嵌入纳米颗粒，导致结合在纳米颗粒上的DNA构象发生变异，这种结构的改变使DNA免于被酶切[34]。

3 磁性纳米基因载体研究进展

3.1 磁性纳米颗粒作为载体在基因转染中的研究

高效的基因输送技术是将目的基因运送到宿主细胞，随后目的基因在细胞中进行表达，发挥功能。目前有3种主要的基因输送技术，即病毒载体、核酸电穿孔和核酸转染，3种系统的效能见表1[27]。病毒载体虽然具有很高的转染效率，但可能会将病毒载体的基因插入宿主基因组，导致有害基因的表达。电穿孔也可将外源基因高效地转运至宿主，但电刺激会导致50%的受体细胞死亡。通常使用的转染试剂虽然对细胞的生长发育影响不大，但转染效率不高影响了它们在临床上的使用。磁性纳米颗粒具有良好的结合与保护DNA的能力，作为基因载体可以高效转运基因进入细胞，并且对细胞有很低的毒性，在医学上具有很好的应用前景。

Zhang等用PEI包裹的磁性纳米颗粒作为载体连接小干扰RNA（siRNA）和含有绿色荧光蛋白（GFP）的质粒，在外加磁场的作用下转染3D细胞，siRNA的转染效率为64%，GFP质粒的转染效率为77%，使用短发夹RNA（shRNA）质粒沉默GFP的表达，效率达到 82%[35]。Kievit等用 PEI、PEG 和 CS形成的共聚物包被氧化铁纳米颗粒，提高了纳米颗粒的生物相容性，降低了细胞毒性，该纳米颗粒能稳定地结合、保护DNA，在外加磁场的作用下可以高效地将DNA转运到肿瘤细胞和异种移植鼠模型的肿瘤中进行表达[36]。超支化聚乙烯亚胺（HPEI）修饰的磁性纳米颗粒转染COS-7细胞，萤光素酶的表达水平比标准的PEI提高了13倍，并且对细胞的毒性作用也大大减小[37]。

自从1988年RNA干扰（RNAi）在线虫体内被发现后，使用RNAi解决人类疾病受到极大关注，许多科学家尝试用RNAi技术来治愈mRNA水平的疾病。siRNA能识别并切割靶mRNA分子，从而导致目的基因不能表达。使用RNAi技术治疗疾病的主要问题是如何将siRNA运送至靶细胞，提高它们在体内的生物利用度，以及避免核酸酶的消化。为了克服这些难题，迫切需要强大的转运载体[38]。实验发现，聚合物包被磁性纳米颗粒可以携带siRNA等多种物质进入靶器官，并且可以保护siRNA免受核酸酶的消化[39]。氧化铁纳米颗粒携带siRNA可以敲除小鼠肿瘤细胞内GFP基因的表达[40]。与传统的基因治疗方法相比，在纳米颗粒表面修饰靶向性物质可以提高治疗效能，降低纳米颗粒对细胞的毒性。通过这种提高的通透性和滞留效应，大分子的治疗物质积累于肿瘤内部。靶向性转运方法包括细胞特异性靶向配体的使用，这种配体可以和细胞表面的受体结合。近年来的一些研究强调了这些靶向配体在提高运送效能方面的重要性[41-44]。研究证明，在纳米颗粒表面连上一个特异性靶标肽，可以增加肿瘤对纳米颗粒的吸收量及纳米颗粒复合物的利用度，提高沉默效应[45]。铁转运蛋白靶向的siRNA纳米颗粒复合物显著抑制了肿瘤的生长[44]，降低肿瘤萤光素酶的活性[46]。

表1 基因输送系统

3.2 磁性纳米颗粒与脂质体、细胞穿膜肽结合在基因转染中的研究

Yang等用脂质体包被携带增强型GFP（EGFP）的四氧化三铁磁性纳米颗粒，转染He99肺癌细胞，结果表明即使没有磁场的作用，包被脂质体的磁性纳米颗粒转染效率要高于脂质体介导的转染效率，在外加磁场的作用下转染效率进一步提高[2]。细胞穿膜肽带正电荷，能携带小分子、蛋白质、核酸等物质进入细胞，其穿膜能力不依赖于细胞的内吞作用。Song等通过静电作用将细胞穿膜肽Tat肽与磁性纳米颗粒DNA结合，在外加磁场的作用下将此复合物转染人体细胞，发现转染效率比没有Tat肽存在时提高了4倍；将该复合物通过腰椎注射入鼠脊髓，在动物背部从注射部位到脑部移动磁铁，结果显示，在外加磁场的作用下目的基因转运至靶部位进行了表达，转染效率比没有Tat肽存在时提高了2倍[47]。

3.3 磁性纳米颗粒与病毒载体结合在基因转染中的研究

病毒载体的靶向性是体内基因传递的一个主要难题，将病毒载体与磁性纳米颗粒结合进行转染，在外加磁场的作用下可以实现基因的靶向运输，提高转染效率。

Kamei等将腺病毒（adenovirus，Ad）基因转运载体结合到金/氧化铁磁性纳米颗粒（GoldMAN）上形成Ad/GoldMAN复合物，用该系统转染小鼠黑色素瘤细胞，在外加磁场作用下，与单独使用Ad载体进行基因转染相比，该转染系统使基因表达水平提高了1000倍，Ad/GoldMAN复合物直接进入细胞膜，不依赖于细胞表面的病毒受体和细胞的内吞作用，这种机制有助于提高Ad载体的基因表达效率[48]。Hof⁃mann等将携带GFP基因的慢病毒载体与磁性纳米颗粒结合，在外加磁场作用下转染人脐静脉内皮细胞，GFP获得高水平的表达，而在相同条件下没有磁性纳米颗粒的慢病毒载体介导的转染，荧光蛋白的表达水平很低；相同的情况发生在原代鼠上皮细胞、鼠成纤维细胞、猪皮肤成纤维细胞上。将慢病毒载体与磁性纳米颗粒复合物注入鼠颈动脉后，在外加磁场的作用下可以改变慢病毒颗粒在机体组织内的分布[49]。将溶瘤腺病毒与磁性纳米颗粒结合，在外加磁场的引导下感染肿瘤多药耐药细胞株，结果发现外加磁场存在时细胞对有磁性病毒的吸收量与没有磁性病毒相比增加了10倍，增强了病毒的溶瘤效应。将溶瘤腺病毒/磁性纳米颗粒复合物注射入小鼠移植瘤模型，在外加磁场作用下，具有磁性的腺病毒与单独的腺病毒相比显示了更强的溶瘤能力[50]。外源基因可以在Ad载体的介导下进入动物的脑，如果将Ad载体直接注入鼠胚胎脑室，Ad会均匀地感染脑室表面的神经干细胞，而不能将目标基因转运至鼠胚胎脑室靶部位。将生物素化的Ad载体与链霉素结合的磁性纳米颗粒连接到一起，当Ad载体/磁性纳米颗粒复合物被注入鼠胚胎脑室后，磁铁被置于胚胎的头部，病毒载体/磁性纳米颗粒复合物将携带的外源基因运送脑的靶部位[51]。

4 结语

磁性纳米颗粒可以携带外源DNA进入细胞及动物机体，当磁性纳米颗粒/DNA复合物进入细胞后，磁性纳米颗粒与外源DNA如何解离，外源DNA如何进入细胞核进行表达并发挥功能，以及与外源DNA解离后的磁性纳米颗粒从细胞中排出的途径尚无定论，有待于进一步研究。

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