自制超声/荧光双功能造影剂在兔正常淋巴结中的显像

曲恩泽，戴志飞，王淑敏，梁晓龙，柯亨特，王金锐

1北京大学第三医院超声诊断科，北京 100191 2北京大学工学院生命科学系，北京 100190

自制超声/荧光双功能造影剂在兔正常淋巴结中的显像

曲恩泽1，戴志飞2，王淑敏1，梁晓龙2，柯亨特2，王金锐1

1北京大学第三医院超声诊断科，北京 1001912北京大学工学院生命科学系，北京 100190

目的制备一种能够超声/荧光双模式成像的造影剂，通过动物实验观察其对淋巴管及淋巴结超声造影和近红外活体荧光成像的效果。方法组装嵌合淋巴结靶向配体(磷脂酰丝氨酸)和近红外荧光物质的双功能靶向造影微泡，行光学显微镜及粒径检测，观察其形态与大小。选取5只正常新西兰大白兔，于双侧足垫注射双功能造影剂，同时观察其淋巴结、淋巴管超声造影及近红外荧光表现。于同部位注射活性蓝染料，5 min后处死动物后取淋巴结行病理检查。结果脂质微泡超声造影剂粒径分布均匀、形态规则，直径约3～5 μm。超声造影剂经皮下注射后可很快显示流入的淋巴管及相应淋巴结，近红外荧光成像与超声造影图像有良好的一致性。解剖证实所有蓝染的淋巴结均可荧光成像。结论自制双功能超声造影剂经皮下注射对兔正常淋巴结的造影效果良好，且同步可行近红外荧光成像，有望成为一种淋巴结示踪的良好方法。

超声造影；荧光成像；微泡；淋巴结

ActaAcadMedSin，2013,35(4)：411-415

淋巴结的定位与检查对于确定恶性肿瘤的分期、手术术式的选择及治疗方案有着极其重要的作用，尤其前哨淋巴结更是临床关注的焦点。近年来，经皮下注射近红外荧光染料示踪淋巴结因其快捷直观且具有较高的敏感性，已经成为临床研究和应用的热点之一。而嗜网状内皮系统的微泡造影剂更是体现出在超声淋巴造影中的较强特异性。然而，两种方法都存在各自的缺陷。本研究选择淋巴细胞特异性配体磷脂酰丝氨酸和穿透力较强的近红外荧光染料组装到超声造影剂微泡表面，使造影剂选择性结合于淋巴结，得到特异性“标记”，利用超声扫查和激发光照射实现超声/荧光双模式靶向显像，获取淋巴管及淋巴结的解剖和功能信息，旨在克服单独应用一种显像模式的缺陷，为临床提供更准确的诊断和治疗依据。

材料和方法

材料正常新西兰大白兔5只，北京大学医学部实验动物部提供，雄性，体重1.8～3.0 kg；Peg 40s(美国Sigma公司)，磷脂酰丝氨酸(PS，美国Avanti公司)，专利蓝(Patent blue，美国Avanti公司)，近红外荧光染料(Cy7，北京美科美生物技术开发有限公司)；超声波细胞破碎机(美国Misonix公司)；Mastersizer 2000颗粒粒度分析仪(英国Malvern公司)；Philips IU22超声诊断仪，L9- 3探头，MI：0.06(Philips公司)；医用光子眼(PDE，日本滨松公司)。

造影剂制备将Peg 40s、Ps以摩尔比9∶1溶于氯仿中，并加入0.15 mg Cy7，旋干后加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)中混匀移至灭菌锅高温高压处理(120℃/15 min)，然后磁力搅拌冷却至室温。将上述混悬液转移至烧杯中，以恒定速度通入C3F8气体，使用超声波细胞破碎仪的1/8探头以最大输出功率连续处理3 min；声振处理后将得到淡绿色混悬液收集与分液漏斗中，静置60 min后取中层微米级微泡放入4℃冰箱中保存[1]。

基本性质检测取少量脂质微泡造影剂溶于生理盐水中以普通光学显微镜观察形态及大小，使用颗粒粒度分析仪检测其粒径分布。

动物实验超声淋巴造影：正常新西兰大白兔以乌拉坦(4 ml/kg)麻醉后备皮，在足垫处注射 0.25 ml双功能造影剂，用L9- 3探头观察腘窝淋巴结及流入淋巴管的显影情况，储存动态图像并测量大小。

近红外荧光成像：经足垫注射造影剂后使用医用光子眼(激发波长770 nm，发射波长805 nm)观察，范围自足底至腘窝，储存图像并记录淋巴管及淋巴结数量。

活性蓝染色后解剖：同部位注射0.25 ml专利蓝溶液(1%)，5 min空气栓塞法处死动物，剥皮后寻找蓝染的淋巴管和淋巴结，将淋巴结取出行近红外荧光成像后置于10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋、HE染色。

统计学处理采用SPSS 19.0统计软件，二维超声所测得淋巴结大小与超声造影所测得淋巴结大小之间的比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

双功能造影剂的基本性质普通光学显微镜下观察：形态规则，呈球形，大小较均匀(图1)。经颗粒粒度分析仪测定粒径大小为：3～5 μm左右(图2)。

图1 普通光学显微镜下观察造影剂，显示为形态规则、大小均一的微泡

Fig1 The contrast agent microbubbles showed regular shape and uniform size in optical microscope

图2 颗粒粒度分析仪测定微泡大小分布大部分为3～5μm

Fig2 Particle analyzer shows that the size distribution of the microbubbles is about 3- 5μm

超声淋巴造影结果共发现10个显影的腘窝淋巴结，于足垫注射造影剂后约15～45s即可探查到，可见1～2根流入淋巴管(图3A、4A)。二维超声淋巴结测量大小为(0.33±0.12)cm2，超声造影测量大小为(0.35±0.09)cm2，差异没有统计学意义(P>0.05)。淋巴造影平均显影持续时间约为20 min。

近红外荧光成像结果共发现10个显像的腘窝淋巴结，于双侧足垫注射造影剂后1 min内均可见自足底至腘窝的引流淋巴管及相应的腘窝淋巴结，淋巴管平均1～2根，其位置及数量均与超声造影图像良好的对应(图3B、4B)。荧光成像平均显影持续时间大于2h。

活性蓝染色后解剖结果剥皮后可见位于皮下的蓝染淋巴管，沿淋巴管钝性分离肌肉组织可找到位于腘窝的蓝染的淋巴结，共发现10个蓝染的淋巴结。取出后的淋巴结仍可荧光成像，证实为之前由造影剂定位的淋巴结(图5)。所有淋巴结均病理证实为正常淋巴结结构。

A.双幅模式超声造影，可见2条流入淋巴管(蓝箭头)和1个淋巴结(红箭头)；B.相对应的近红外荧光成像，可见2条流入淋巴管(蓝箭头)及1个淋巴结(红箭头)

A.the dual-mode ultrasound imaging shows two inflow lymphatic vessels(blue arrows)and a lymph node(red arrows)；B.the corresponding near-infrared fluorescence imaging shows the identical results of two inflow lymphatic vessels(blue arrows)and a lymph node(red arrow)

图3 淋巴结的超声/荧光成像

Fig3 The imaging of lymph node by contrast-enhanced ultrasound/near infrared fluorescence

A.双幅模式超声造影，可见1个淋巴结(红箭头)；B.相对应的近红外荧光成像，可见1个淋巴结(红箭头)及1条流入淋巴管(蓝箭头)

A.the double-mode ultrasound imaging shows one lymph node(red arrows)；B.the corresponding near-infrared fluorescence imaging shows a lymph node(red arrow)and an inflow lymphatic vessels(blue arrow)

图4 淋巴结的超声/荧光成像

Fig4 The imaging of lymph nodes by contrast-enhanced ultrasound/near infrared fluorescence

A.左侧为腹股沟区淋巴结(未蓝染)，右侧为腘窝淋巴结(蓝染)；B.蓝染的淋巴结可以荧光成像(右侧)

A.the anatomical imaging of inguinal lymph nodes(left and not blue-stained)and the popliteal lymph node(right and blue-stained)；B.the fluorescence imaging of blue-stained lymph nodes(right)

图5 蓝染淋巴结的荧光成像

Fig5 The imaging of blue-stained lymph node by near infrared fluorescence

讨 论

淋巴结的无创性检查一直是临床关注的焦点。在恶性肿瘤的诊断和治疗中评价肿瘤引流区域内的淋巴结非常重要，直接关系到手术术式及治疗方案的选择。目前临床常用的寻找肿瘤引流淋巴结的方法包括淋巴闪烁造影以及使用活性蓝染料配合外科解剖。用于淋巴闪烁显像的显像剂有99mTC-硫胶体、99mTC-纳米胶体以及99mTC-异构三硫酸盐胶体等；活性蓝染料则包括国外常用的异硫蓝、专利蓝以及国内常用的亚甲蓝等[2]。然而前者的空间分辨率较低，且有放射污染，故限制了在临床的广泛应用；后者不仅是有创性检查，更由于染料在淋巴系统内移动速度快，故对于操作者的时间窗要求较高；并且只能显示视野表面的染色淋巴结，对较深在的淋巴结无法显示，因此也存在较大的局限性。近几年经皮下或肿瘤周围注射近红外荧光染料吲哚氰绿行活体荧光成像寻找前哨淋巴结在国内外已有应用，因其使用方便、成像快速且持续时间长而受到外科医生的重视。但是近红外染料受限于成像深度(不超过1cm)，从而影响了其在显示深部淋巴结的应用。

Sonazoid是一种特异性嗜网状内皮系统的超声微泡造影剂，由全氟丁烷微泡和脱水的磷脂酰丝氨酸构成，微泡直径约2.4～3.5μm[3]。磷脂酰丝氨酸可被淋巴结中的巨噬细胞特异性吞噬，研究表明，皮下注射Sonazoid经淋巴管转运后能够在引流淋巴结内停留足够长时间(>3h)，从而有利于术中超声扫描识别前哨淋巴结，并且能够显示充盈缺损的微小转移灶[4]。更重要的是，Sonazoid仅存留于前哨淋巴结中，而不会进入到下一级引流位点(如二级淋巴结)，该特性克服了淋巴闪烁造影或蓝染技术的局限性，避免了前哨淋巴结和二级淋巴结的混淆现象。

尽管淋巴结特异性超声造影剂有着较高的敏感性(81.8%)，但是很多研究也指出其寻找淋巴结时需要依据解剖特点行大范围扫查，从而增加了定位的难度；而对于极表浅的如位于皮下的淋巴结或进入胸腔的淋巴结则存在因超声技术的限制无法显像等缺点[2]。

本研究构建的双功能造影剂通过连接磷脂酰丝氨酸和近红外荧光染料，获得了与Sonazoid同样的淋巴结靶向超声造影效果，并且同时具有近红外线荧光显像的能力。从而成功地结合了超声淋巴造影和活体荧光显像的优势，同时弥补各自的缺陷，提供了一种深浅兼顾的淋巴结定位方法。即超声造影可以解决活体荧光成像深度不足的问题，而荧光成像可以敏感地显示超声造影不易发现的表浅淋巴结。

本研究中超声淋巴造影及活体荧光成像同步发现10个腘窝淋巴结，活性蓝染料配合解剖证实为10个腘窝淋巴结，双功能造影剂的准确性为100%，且两者的一致性良好。超声造影测量的淋巴结大小与二维图像测量的大小没有统计学差异。在实验过程中发现活体荧光淋巴结成像速度很快，往往于注射造影剂后1 min内即可见引流的淋巴管及相应的淋巴结，图像直观且持续时间长。但有时图像不够理想，往往是由于穿透深度不足导致的，此时通过用力挤压组织可以改善成像效果。超声淋巴造影的不足之处则是由于技术原因导致的对极浅表或位于含气体脏器结构(例如肺、肠管)后方的淋巴结显示不满意。本课题组另外进行的肿瘤淋巴结显像中就发现单独应用超声造影往往难以找到腹股沟区皮下淋巴结，而活体荧光成像则能够非常清晰的指出淋巴结的位置，定位后通过加水垫再观察则可以找到造影增强的淋巴结。然而超声淋巴造影不仅能够测量淋巴结的大小，同时可以评估淋巴结内的功能，从而在术前为临床提供更详尽的信息，这个优势是荧光成像或其他影像学检查不可比拟的。

本研究不足之处首先是造影剂的结构还不够稳定，超声造影的持续时间目前未能达到最理想的状态(>3h)，这将在本课题组今后的工作中进一步完善。另外由于此次研究选用的是正常的兔腘窝淋巴结，所有的淋巴结均表现为造影剂充盈完整，未能更好的体现出超声淋巴造影的优势所在，所以本课题组下一步工作是观察肿瘤淋巴结的灌注情况，以评估双功能造影剂对于术前诊断的意义。

综上，本研究结果显示，通过结合超声淋巴造影和活体荧光成像的双功能优势，可以更直观、更准确且无创快速地定位淋巴结，并且同时实现淋巴结的解剖和功能成像，有望成为未来临床评估前哨淋巴结的好方法。

[1] Xing ZW，Wang JR，Ke HT，et al.The fabrication of novel nanobubble ultrasound contrast agent for potential tumor imaging[J].Nanotechnology，2010，21(14)：145607.doi:10.1088/0957- 4484/21/14/145607.

[2] Goldberg BB，Merton DA，Liu JB，et al.Contrast-enhanced ultrasound imaging of sentinel lymph nodes after peritumoral administration of sonazoid in a melanoma tumor animal model[J].J Ultrasound Med，2011，30(4)：441- 453.

[3] Sontum PC，Ostensen J，Dyrstad K，et al.Acoustic properties of NC100100 and their relation with the microbubble size distribution[J].Invest Radiol，1999，34(4)：268- 275.

[4] Goldberg BB，Merton DA，Liu JB，et al.Contrast-enhanced sonographic imaging of lymphatic channels and sentinel lymph nodes[J].J Ultrasound Med,2005，24(7)：953- 965.

Self-madeUltrasound/fluorescentBi-functionalContrastAgentforRabbit’sNormalLymphNodeImaging

QU En-ze1，DAI Zhi-fei2，WANG Shu-min1，LIANG Xiao-long2，KE Heng-te2，WANG Jin-rui1

1Department of Ultrasound，Peking University Third hospital，Beijing 100191，China2Department of Life Sciences，Peking University Institute of Technology，Beijing 100190，China

WANG Jin-rui Tel：010- 82265582，Fax：010- 82265851，E-mail：jinrui_wang@sina.com

ObjectiveTo prepare a lymph node-targeted ultrasound/fluorescence bi-functional imaging contrast agents，and observe its effectiveness both on contrast-enhanced ultrasound(CEUS)and vivo near infrared fluorescence(NIR)imaging through animal experiments.MethodsThe chimeric lymph node-targeted ligand(phosphatidylserine)and near-infrared fluorescent substance were assembled to form bi-functional contrast microbubbles.The morphology and size distribution were detected by optical microscope and Malvern potential tests.Five normal New Zealand white rabbits were subcutaneously injected with the prepared contrast agent in bilateral footpads，and the imaging effectiveness of lymph nodes and lymphatic vessel were observed by CEUS and NIR technique.Then blue dye was subcutaneously injected at the same site，and the rabbits were sacrificed for lymph nodes pathological examination.ResultsLipid ultrasound microbubbles，with a mean size of 3- 5 μm in diameter，appeared to be uniform in distribution and regular in configuration.The images of inflow lymphatic vessel and relevant lymph node were quickly showed up after the subcutaneous injection by CEUS，which was identical to the result detected by NIR.Biopsy confirmed that all the blue-stained lymph nodes could be displayed by NIR.ConclusionsThe self-made bi-functional contrast agent has a good imaging ability in CEUS and NIR imaging.It may be a better agent as lymph node tracer.

ultrasound contrast；fluorescence imaging；microbubbles；lymph node

王金锐 电话：010- 82265582，传真：010- 82265851，电子邮件：jinrui_wang@sina.com

R445.1

A

1000- 503X(2013)04- 0411- 05

2012- 12- 11)

国家自然科学基金(81171347)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81171347)

10.3881/j.issn.1000- 503X.2013.04.010