重金属胁迫下芫荽生理及挥发性成分变化分析

魏金凤，李光勇，王俊霞，康文艺*

1河南大学中药研究所;2河南大学民生学院，开封 475004;3河南医药技师学院，开封 475008

芫荽为伞形科植物芫荽(Coriandrum sativum L.)的带根全草［1］。又名香菜，香荽和胡荽等，一年生或两年生草本，因其有浓郁香气而得名。我国各地均有栽培，对磷肥的反应最为敏感，磷肥可提高种子精油的含量。芫荽味辛，性温。归肺、脾、肝经。主治风寒感冒，麻疹，痘疹透发不畅，食积气滞，脘腹胀痛或呕恶，此外，芫荽有升散止痛之功，又有解毒行散之能。芫荽全草及果实均可入药，茎叶作蔬菜和调香料，有健胃消食作用;果入药，有驱风、透疹、健胃、祛痰之效［2］。

国内外对使用不同提取方法所得挥发油的报道颇多，但还未见用固相微萃取技术提取芫荽挥发性成分的报道。前人的研究集中在芫荽挥发油体外抗菌和抗氧化活性方面。周凌霄等［3］对芫荽精油的研究表明，对大肠杆菌和白葡萄球菌的抑制作用。J.C.Matasyoh［4］等报道水蒸气蒸馏法所得芫荽挥发油对G+金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌以及G-埃希氏菌属、沙门氏菌等显示有显著抑菌活性。另有研究发现，芫荽水提物可减轻抗原虫药物甲硝唑引起的基因毒害效应［5］。陆占国等［6］报道超声波法和水蒸气蒸馏法得到的芫荽茎叶精油具有明显地清除亚硝酸盐作用，水蒸气蒸馏法［7］得到的精油亦具有很强的清除DPPH自由基能力，具有很好的抗氧化活性。

土壤系统中的重金属污染与治理一直是国际上的难点与热点研究课题［8］。受重金属离子胁迫的植物可启动多种机制提高对重金属的抗性。从而降低重金属离子对组织细胞的毒害。植物体内的潜在机制主要是通过避免重金属离子在细胞内敏感位点大量积聚，并产生避免重金属离子伤害作用的可溶性蛋白质，使植物增强伤害躲避能力和自我平衡能力。过去的研究大多只注重于单个污染物在土壤中的迁移及对植物生长的影响，随着人们对环境问题的认识不断深入，研究的重点也转向多种污染物复合污染的研究。本实验选择的实验材料芫荽不仅有食用价值，而且有药用价值，因此研究重金属污染对它的影响是十分有意义的，关系到食品安全及用药安全。

1 材料与仪器

1.1 材料

芫荽种子(2011年4月，购于河南省开封市金明区市场)。

1.2 仪器

紫外分光光度计、离心机、水浴锅、磁力搅拌器、酸式滴定管、电感耦合等离子体发射光谱仪(美国Perkin Elmer公司，Optima 2100 DV);6890 N型气相色谱-5975型质谱联用仪(美国安捷伦公司);手动固相微萃取进样器和 65 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS-DVB)萃取头(美国Supelco公司);C6-C26正构烷烃标准品(美国Alfa Aesar公司)。

2 实验方法

2.1 废电池浸出液的制备

取华太5号锌锰干电池若干节，破坏后按1∶20的固液比加入Hoagland营养液［9］，溶液用磁力搅拌器搅拌48 h，静置1 d，再搅拌48 h后，静置1 d用吸管取无色透明上清液待实验使用，所得为浸出原液(以下称原液)。以原液为基础稀释100、50、10倍后得到3个梯度质量分数的废旧电池胁迫液。使用电感耦合等离子体发射光谱仪测得原液中Cr、Cd、Co、Ni、Zn、Mn 的含量依次为 8.8、7.4、13.6、7.8、478.4、144.2 mg/L。

2.2 幼苗的培养及胁迫

实验于2011年4月开始进行，将芫荽种子均匀撒于装土带孔的托盘中，每天光照12 h，傍晚浇水1次，待种子发芽后将植株从盘中脱出，洗净根系，移至装有蛭石的小盆中，置于托盘中。植株在蛭石中适应至长势稳定后，改用经Hoagland营养液稀释不同倍数的废旧电池胁迫液隔天进行胁迫处理。于每天上午9点浇灌胁迫液，隔天胁迫，共处理7次。胁迫开始后的第15 d，从植株上剪取中部茎段的叶片进行各项生理指标的测定。

2.3 测定方法

参照文献［10］方法，考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量;硫代巴比妥酸(TBA)法测定过氧化物脂质MDA含量;愈创木酚法测定POD活性;氮蓝四唑(NBT)还原法测定SOD活力;磺基水杨酸法测定游离脯氨酸含量;苯酚法测定可溶性糖含量。参照文献［11］，高锰酸钾滴定法测定CAT活力，丙酮-无水乙醇等体积混合法测定叶绿素含量。

2.4 实验方案

芫荽幼苗在蛭石中长势稳定之后开始处理，以Hoagland营养液为对照，废旧电池原液用Hoagland营养液分别稀释100倍、50倍和10倍3个梯度浇灌，每个处理重复3次。

2.5 挥发性成分的测定

2.5.1 挥发性成分的提取

将各试验组芫荽在胁迫开始的第15 d拔出，洗净根系，阴干。使用前先将SPME的萃取纤维头在气相色谱的进样口老化10 min，老化温度为250℃，载气体积流量为1.0 mL/min。取各组阴干芫荽叶各0.7 g，置于5 mL的样品瓶中，盖上盖子，插入65 μm PDMS萃取纤维头，于80℃下顶空取样30 min后，立即取出，在气相色谱仪进样口(250℃)，脱附1 min。

2.5.2 GC/MS分析条件

HP-5 MS石英弹性毛细管柱(30.0 m ×250 μm，0.25 μm);载气为高纯氦气(99.999%)，流速为1.0 mL/min;进样口温度为250℃;色谱柱初始温度50℃(保持1.0 min)，以3℃/min升温至120℃(保持2 min)，最后以4℃/min升温至210℃(保持10 min)。不分流进样。

质谱条件:电离方式:EI源，电离能量70 eV;离子源温度为250℃;四极杆温度150℃;传输线温度为280℃;四级杆温度为150℃;电子倍增器电压1765 V。质量扫描范围为30～440 amu，谱图检索:采用RTLPEST3.L和NIST05.L进行检索。

2.5.3 保留指数测定

按照文献［12］，测定各组分的保留时间，计算出各组分的Kovats保留指数。

3 结果与分析

3.1 生理指标的变化

废电池浸出液胁迫对芫荽幼苗渗透调节物质、活性氧系统、膜脂过氧化水平等的影响如图1～3。

图1 废电池浸出液胁迫对芫荽幼苗叶片渗透调节物质含量的影响Fig.1 Effect of waste battery lixivium stress on contents of osmotic adjustment components of seedling leaves of C．sativum

由图1可以看出，随着废电池浸出液稀释倍数的减小，渗透调节物质可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量均呈先升后降的趋势，可溶性糖和游离脯氨酸均在稀释100倍组含量达到最大值，分别为对照组的1.24倍、4.30倍，之后迅速下降。可溶性蛋白含量在稀释50倍组含量达到最大值，为对照组的1.25倍，稀释10倍组稍有下降。一般认为，重金属胁迫下植物体内碳水化合物代谢紊乱，蛋白质的代谢变化也将在一定程度上直接反映植物对重金属胁迫的抗性适应能力大小，细胞内可溶性胁迫蛋白含量增加可以使植物组织细胞减轻伤害，也可参与渗透调节。总观上图，不同浓度废电池浸出液处理组的渗透调节物质中，可溶性糖和脯氨酸含量变化较为明显，说明芫荽幼苗中可溶性糖和脯氨酸对重金属胁迫响应灵敏，芫荽通过积累这些小分子有机化合物，降低植物体内渗透势，增强植物组织和体细胞的渗透调节能力，以利于逆境胁迫下维持植物体正常生长所需水分，稳定生物大分子结构，抵抗重金属胁迫，在一定程度上减弱重金属对植物体的毒害效应，提高抗逆性，是芫荽适应重金属胁迫的重要机制之一。由图1看出，各浓度电池浸出液胁迫后，脯氨酸含量均高于对照组，但污染浓度较高时，脯氨酸及可溶性糖积累量却与受胁迫浓度呈负相关。说明胁迫液浓度增加至一定程度时，幼苗抗重金属污染能力将有所减弱。

图2 废电池浸出液胁迫对芫荽幼苗叶片活性氧系统CAT、SOD活力的影响Fig.2 Effect of waste battery lixivium stress on CAT and SOD activities of seedling leaves of C．sativum

图3 废电池浸出液胁迫对芫荽幼苗叶片POD活力及MDA含量的影响Fig.3 Effect of waste battery lixivium stress on MDA content and POD activity of leaves of C．sativum

活性氧系统及膜脂过氧化水平是植物抗逆性的重要指标。植物膜保护的三大酶系—SOD、POD和CAT是细胞中防止ROS过量产生的重要抗氧化酶系统［13］。由图2、3可以看出，在废电池浸出液胁迫诱导下，芫荽幼苗叶片中SOD、POD活性变化趋势一致，随着电池浸出液稀释倍数的减小，即重金属污染程度的上升，二者活性比对照组明显增加，在稀释50倍组，活性达到最大值，分别为对照组的3.15倍、6.04倍，再减小稀释倍数至10倍，SOD、POD活力分别下降至对照组的2.47倍、3.94倍，仍显著高于对照组。CAT活力在稀释100倍组最大，为对照组的1.32倍，随着稀释倍数的减小，CAT活力依次为对照组的107%、96.41%。抗氧化酶系统中，SOD是防御活性氧的关键酶，能够歧化超氧阴离子自由基为O2和H2O2，而POD和CAT则催化H2O2形成H2O和 O2，只有 SOD、POD、CAT三者协调一致，才能使植物体内活性氧自由基维持在较低的水平，使植物进行正常的生长和代谢。在废电池浸出液复合重金属污染条件下，芫荽叶片中的SOD、POD活性随着稀释倍数的减小，污染程度的加深，活性明显增加，说明这两种酶在芫荽幼苗对复合重金属的抗性中起到主要作用。MDA含量受SOD和POD协同控制，是反映膜脂过氧化水平的重要指标之一，能与细胞内各种成分发生反应，引起酶与质膜损伤，MDA含量变化与膜透性变化呈正相关，反映植物受逆境伤害的程度［14］，电池浸出液稀释 100倍、50倍、10倍组的MDA含量分别是对照组的165.82%、112.03%、105.91%。MDA含量总体呈增加趋势，说明在复合重金属胁迫下抗氧化酶活性有所增加，但芫荽幼苗的质膜在一定程度上受损。

3.2 芫荽叶片中挥发性成分的测定

按2.5所述实验方法和条件，对固相微萃取法提取的芫荽叶挥发性成分进行GC/MS分析，计算机质谱数据系统检索(RTLPEST3.L和NIST05.L)，面积归一化法确定各成分的百分含量，各组分按照从气相色谱HP-5MS柱中流出的顺序，结果见表1。

表1 不同胁迫处理对芫荽叶中挥发性成分及含量的影响Table 1 Effect of waste battery lixivium stress on the volatile components of C．sativum leaves

由表1可以看出，芫荽叶的挥发性成分主要以不饱和脂肪酸酯、饱和烷烃、醛、醇为主。与索氏提取［15］和超声提取［6］所得精油成分有较大差别。其中异戊醛、壬烷、癸酸甲酯、n-棕榈酸仅在废电池浸出液胁迫组中检测到，说明芫荽幼苗在电池浸出液复合污染条件下，通过自身代谢的调节，合成新的挥发性成分。4，5-二(甲氨基)芴在对照组及稀释100倍组检测得到，稀释50倍及10倍组，检测不到该组分。2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二异丁酸酯含量最高(对照组为13.36%)，在受到轻微重金属污染下(稀释100倍组)，含量有所升高，为对照组的118.10%，随着重金属污染程度的加深，含量下降，稀释10倍组，该组分含量为对照组的75.30%。亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯含量的变化均在稀释50倍组达到最大值，分别为对照组的112.66%、150.70%。由此可知，芫荽幼苗在重金属污染调节下，挥发性成分的种类及含量会发生一定的变化，从而可能影响芫荽精油的抗菌、抗氧化等生物活性。

4 结语

本文对废电池浸出液胁迫下的芫荽幼苗从生理及挥发性成分两个方面综合评价复合重金属污染对芫荽食用和药用价值的影响。试验选择开始胁迫后第15 d测定芫荽叶片中生理指标的变化，在于此时处于幼苗期的芫荽，不同稀释倍数重金属溶液胁迫组表观差异明显，与对照组相比，随着胁迫程度加深，芫荽叶片颜色由嫩绿逐渐转为深绿，叶片萎蔫，叶面积减小，叶片生长受阻。芫荽在受到重金属胁迫时，通过主动积累各种渗透调节物质来抵抗逆境，如芫荽叶中可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量在受到轻度胁迫时含量升高，亦由本课题组对荆芥的胁迫研究结果中加以证明［16］。细胞内酶系统总的变化趋势为合成酶类活性下降，而水解酶类及某些还原酶类活性增高。植物受到轻中度逆境胁迫时，保护酶体系的主要酶类超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性上升，重度逆境胁迫时，其活性将有不同程度下降［17］。本研究发现，在适度的废电池浸出液胁迫条件下(稀释100倍)，芫荽幼苗抗氧化酶活性增高，清除活性氧的能力增强;随胁迫液浓度上升，抗氧化酶活性有下降趋势，且呈浓度依赖性，导致幼苗抵御活性氧能力减弱，表明芫荽幼苗具有一定的抗重金属污染能力。另外，某些挥发性成分在对照组中检测不到，却在受重金属胁迫的芫荽幼苗叶片中检测出来。废旧电池浸出液中含有多种重金属离子，复合作用十分复杂，可能因植物组织或部位不同，重金属浓度和比例不同，引起表观生理指标及挥发性成分含量变化。这些成分含量的变化表明，芫荽生长在受到较低浓度重金属离子胁迫时，机体内部通过自身代谢的调节抵御逆境，及某些特定酶的参与，进而引起芫荽挥发油中具有天然活性的挥发性成分的变化，其药用价值是否随之受影响及影响的大小，有待进一步深入的研究。

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