人食管鳞癌组织中RhoC和Ki-67的表达及意义

林尤恩, 倪仰鹏, 王晓芬, 王春冰

(揭阳市人民医院，广东 揭阳 522000)

人食管鳞癌组织中RhoC和Ki-67的表达及意义

林尤恩△, 倪仰鹏, 王晓芬, 王春冰

(揭阳市人民医院，广东 揭阳 522000)

目的检测人食管鳞癌组织中RhoC和Ki-67的表达，探讨它们在食管鳞癌发生发展中的作用及相关性。方法采用免疫组织化学方法(二步法)，检测分析52例人食管鳞癌组织中RhoC和Ki-67蛋白的表达情况及其与患者临床病理特征的关系。结果(1)食管鳞癌组织RhoC蛋白的阳性表达率为61.5%(32/52)，相应癌旁组织RhoC阳性表达率为29.7%(11/37)，差异显著(P<0.05)。(2)RhoC表达与食管鳞癌临床TNM分期和淋巴结转移密切相关，TNM Ⅲ期食管鳞癌组织中RhoC阳性表达率为78.3%(18/23)，显著高于TNM Ⅰ～Ⅱ期的48.3%(14/29)(P<0.05)；伴有淋巴结转移的食管鳞癌组织中RhoC阳性表达率为81.8%(18/22)，显著高于无淋巴结转移的46.7%(14/30)(P<0.05)。(3)食管鳞癌组织中，RhoC与Ki-67的表达呈显著正相关(r=0.322，P<0.05)，均呈升高趋势。结论RhoC的高表达与食管鳞癌的分期、淋巴结转移及细胞增殖密切相关。RhoC可成为食管鳞癌早期诊断和判断预后的辅助指标。

食管肿瘤； RhoC蛋白； Ki-67抗原

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤死亡率的前10位，但食管癌的发病机制尚不清楚[1]。广东省东部的潮汕地区是我国唯一的食管癌沿海高发区，然而食管癌早期临床症状不明显，大多数患者就诊时已处于中晚期，已失去手术的机会。因此，本研究旨在探索食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)早期诊断的生物指标，分析其对ESCC个体化治疗的指导意义和临床价值。

Ras同源蛋白C(Ras homology C, RhoC)是小分子G蛋白超家族中Rho亚族的成员蛋白之一，近年研究表明RhoC在多种肿瘤中高表达，尤其是转移方面的作用突出，已成为肿瘤靶向治疗研究的热点之一。Ki-67是一种核抗原，是评价恶性肿瘤细胞增殖活性的常用指标。本研究通过免疫组化方法检测ESCC组织中RhoC蛋白的表达及其与临床病理特征之间的关系，并探讨RhoC与Ki-67表达的相关性。

材 料 和 方 法

1材料

52例食管癌的标本来自揭阳市人民医院2007～2011年病理科存档蜡块，患者均为首诊，未进行放、化疗及免疫治疗。其中男38例，女14例，年龄41～73岁，平均年龄58岁。所有病例切片经HE染色确诊，病理类型均为鳞状细胞癌，另外37例为部分肿瘤对应的邻近正常食管黏膜。根据WHO 1977年食管肿瘤分类标准进行组织学分类，其中高/中分化鳞癌35例，低分化鳞癌17例，发生区域淋巴结转移22例。肿瘤临床分期参照2009年国际抗癌协会(UICC)制定的TNM分期标准。

2试剂及方法

羊抗人RhoC多克隆抗体购自Santa Cruz(1∶100稀释)，鼠抗人Ki-67单克隆抗体(1∶100稀释)、HRP标记的Ⅱ抗工作液及DAB显色剂均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

取组织蜡块连续切片，切片厚度4 μm，常规脱蜡水化，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，微波抗原修复20 min(0.01 mol/L柠檬酸缓冲液)，5%正常羊血清封闭，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜；Ⅱ抗工作液室温孵育1 h，DAB显色5 min，冲洗以终止反应。常规苏木素复染，脱水，透明，封片。同时用PBS代替Ⅰ抗作染色的阴性对照，用已知的染色阳性切片作阳性对照。

3结果判断

RhoC蛋白的表达主要定位于细胞浆，阳性细胞呈黄色或棕黄色颗粒，弥漫性或局灶性分布。每张片子随机观察5个高倍视野(×400)计数肿瘤细胞总数和阳性细胞个数，得出阳性细胞百分率，分为4个等级：<25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分。根据免疫组化染色强度分为3个等级：无着色为0分，浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分，并将评分结果归为阴性表达(积分<3分)和阳性表达(积分≥3分)2组。

Ki-67蛋白的表达主要定位于细胞核，阳性细胞为棕色颗粒。每张片子随机观察5个视野(×200)中Ki-67表达的肿瘤细胞占的百分比，其均值<30%的癌细胞表达为低表达，≥30%为高表达。

4统计学处理

结 果

1RhoC在ESCC及癌旁组织中的表达情况

RhoC蛋白的表达主要定位于细胞浆，ESCC组织中RhoC蛋白的阳性表达率为61.5%(32/52)，相应癌旁组织RhoC阳性表达率为29.7%(11/37)，差异显著(P<0.05)，见图1。

Figure 1. Expression of RhoC and Ki-67 proteins in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) detected by immunohistochemical staining. A: high expression of RhoC in ESCC (SP,×400); B: negative expression of RhoC in adjacent histologically normal epithelium (SP,×200); C: negative expression of RhoC in adjacent histologically normal epithelium (SP,×400); D: high expression of Ki-67 in ESCC (SP,×400).

图1免疫组织化学检测RhoC和Ki-67在ESCC组织中的表达

2RhoC在ESCC的表达与临床病理特征之间的关系

RhoC表达与ESCC临床TNM分期和淋巴结转移密切相关，TNM Ⅲ期的ESCC组织中RhoC阳性表达率为78.3%(18/23)，显著高于TNM Ⅰ～Ⅱ期的48.3%(14/29)(P<0.05)；伴有淋巴结转移的食管鳞组织中RhoC阳性表达率为81.8%(18/22)，显著高于无淋巴结转移的46.7%(14/30)(P<0.05)。RhoC表达与性别、年龄、部位、病变长度和分化程度无明显相关，见表1。

3RhoC的表达与Ki-67之间的相关性

ESCC组织中RhoC与Ki-67的表达呈显著正相关(r=0.322，P<0.05)，见表2。

讨 论

Rho家族是小分子G蛋白超家族的重要成员，已被证实的成员包括Rho、Rac、Cdc42、Rnd、RhoD和TTF等，这些成员蛋白在许多重要的细胞活动中起作用，如参与基因转录、细胞周期调控，并与细胞凋亡、肿瘤侵袭等密切相关。其中RhoC基因定位于1p13～p21，RhoC蛋白含193个氨基酸，是相对分子质量大约为21 kD的GTP结合蛋白。近年来的研究显示，RhoC在多种肿瘤如乳腺癌[2]、肝细胞癌[3]、胃癌[4]、头颈部鳞癌[5]、前列腺癌[6]、非小细胞肺癌[7]等均呈高表达，并参与细胞恶性转化和浸润转移[8]。

表1RhoC在ESCC中的表达及其与临床病理特征的关系

Table 1. The relationships between RhoC expression and clinicopathological characteristics in ESCC

ParameternRhoCexpressionPPositiveNegativeTotal523220Age(year) ≤451174>0.05 >45412516Sex Male382612>0.05 Female1468Differentiation Well/moderate352015>0.05 Poor17125TNMstage Ⅰ～Ⅱ291415<0.05 Ⅲ23185Lymphnodemetastasis Yes221840.01 No301416

表2ESCC组织中RhoC表达与Ki-67的相关性

Table 2. The relationship between RhoC and Ki-67 expression in ESCC

Ki-67RhoCexpressionTotalPositiveNegativePositive271138Negative5914Total322052

r=0.322,P<0.05.

RhoC与ESCC发生及发展的研究仍较少，Faried等[9]应用体外和体内实验研究发现，RhoA和RhoC蛋白均参与ESCC肿瘤的生长、浸润和转移，其中RhoC促进细胞浸润转移的能力更强。随后应用qPCR检测发现ESCC细胞株和患者标本中RhoC mRNA的水平较正常组织显著升高，且与肿瘤的进展与转移密切相关[10]。Zhang等[11-12]首次应用免疫组织化学方法检测RhoC在ESCC中的表达情况并发现RhoC蛋白的高表达与ESCC淋巴结转移及患者的不良预后有关。赵志华等[13-14]采用半定量RT-PCR和原位杂交方法检测显示，RhoC mRNA在ESCC组织中显著增加，并与ESCC生物学行为密切相关。本研究检测发现，RhoC的高表达与ESCC分期和淋巴结转移密切相关，与上述研究者的报道一致，进一步提示RhoC蛋白有望成为ESCC早期诊断和判断预后的一个有效指标。

Ki-67是Gerdes等[15]在1983年报道的一种单克隆抗体，其抗原是一种与细胞增殖相关的核蛋白，表达于细胞周期中除G0及G1早期外的其它各期。研究发现，Ki-67作为标记细胞增殖状态的抗原，与ESCC的发生、转移和预后密切相关，被认为是反映ESCC肿瘤细胞增殖活性的理想指标[16-17]。目前国内外尚无关于RhoC蛋白和Ki-67抗原表达关系在ESCC中的研究报道，为了进一步从蛋白水平研究RhoC与ESCC细胞增殖的关系，本研究通过免疫组化染色方法，首次联合检测RhoC和Ki-67在ESCC中的表达情况。结果显示ESCC组织中RhoC与Ki-67的表达呈正相关，均呈升高趋势，提示RhoC可能通过调控肿瘤细胞的增殖参与ESCC的发生发展过程，然而相关机制仍有待进一步研究。

综上所述，RhoC的高表达与ESCC的分期和淋巴结转移密切相关，并可能通过参与肿瘤细胞增殖的调控，促进ESCC的进展和转移。因此，RhoC有望成为ESCC早期诊断和判断预后的辅助指标。

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ExpressionandclinicalsignificanceofRhoCandKi-67inhumanesophagealsquamouscellcarcinomatissues

LIN You-en, NI Yang-peng, WANG Xiao-fen,WANG Chun-bing

(JieyangPeople’sHospital,Jieyang522000,China.E-mail:un-lin@qq.com)

AIM: To investigate the expression and significance of RhoC and Ki-67 in human esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissues.METHODSThe expression of RhoC and Ki-67 was detected in 52 specimens of ESCC by the method of immunohistochemistry. The clinicopathological features were also analyzed.RESULTSThe expression of RhoC was detected in 32 of the total 52 (61.5%) cases of human ESCC tissues, significantly higher than that in the adjacent histologically normal epithelium, which was only in 11 of 37 cases (29.7%,P<0.05). RhoC expression was closely correlated with clinical tumor-node-metastasis (TNM) stage (P<0.05) and lymph node metastasis (P<0.05) in ESCC. The over-expression of RhoC was positively correlated with Ki-67 in ESCC (r=0.322,P<0.05).CONCLUSIONThe over-expression of RhoC protein significantly correlates with advanced TNM stage, lymph node metastasis and cell proliferation ability of ESCC. Therefore, RhoC may be a new auxiliary parameter for early diagnosis and prognostic evaluation of ESCC.

Esophageal neoplasms; RhoC protein; Ki-67 antigen

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.030

1000- 4718(2013)06- 1133- 04

2013- 01- 07

2013- 03- 32

△通讯作者 Tel: 0663-8660233; E-mail: un-lin@qq.com