眼用制剂中防腐剂的研究应用进展*

陈 曦，刘美欣

(天津市眼科医院，天津 300020)

眼睛为心灵的窗户，作为重要的感觉器官，在人类与外界交流的过程中发挥着直接且无可替代的作用。由于眼睛对人类的独特功能，及其本身的脆弱、敏感性，眼科疾病的诊治、眼用制剂的研发一直是医学、药学工作者研究的重中之重。而在眼用制剂中，防腐剂的安全性、长期接触的潜在危险以及其所带来的不良反应日益受到眼科医师和药师的重视。本文就国内外眼用制剂中防腐剂的应用现状、长期局部应用含防腐剂滴眼剂引起的眼表改变的实验室及临床研究、现阶段应对策略及注意事项和未来新型防腐剂及眼用制剂包装发展趋势予以综述。

1 防腐剂简介

1.1 防腐剂的定义

防腐剂(preservatives)一般指用于抑制微生物生长和繁殖、延长物质的保存时间、抑制物质腐败的药剂。根据使用习惯，用于固体、半固体制剂中称为防腐剂，在滴眼剂和注射剂中也称为“抑菌剂”，在食品工业中称为“保存剂”。

1.2 眼用制剂中的防腐剂 《美国药典》(USP/NF)对眼用制剂中防腐剂的使用必要性有着明确的规定，其内容为“In the case of sterile articles packaged inmultiple－ dose containers，antimicrobial preservatives are added to inhibit the growth ofmicroorganisms thatmay be introduced from repeatedly with drawing individual doses.”《中国药典》对于眼用制剂的定义，由2005年版的“直接用于眼部发挥治疗作用的制剂”，提升为2010年的“直接用于眼部发挥治疗作用的无菌制剂”。可以看出，2010年版《中国药典》附录ⅠG中强调了眼用制剂生产过程中对灭菌工艺的严格要求，以及眼用制剂在贮藏、运输、使用过程中的无菌性要求(明确规定眼用制剂在启用后最多可以使用4周)。同时2010年版药典也增加了对眼用制剂中防腐剂(抑菌剂)的使用及质量控制的明确规定，其中包括:①增加了对氧氟沙星滴眼液等6个品种滴眼液的抑菌剂的含量测定项要求;②增加了抑菌剂效力检查方法指导原则(附录ⅩⅨN)，用于评价抑菌效力及确定抑菌剂的浓度。

1.3 防腐剂的分类和作用机制 国内外常用的眼用制剂防腐剂根据其化学结构主要可以分为5类［1］，分别为季铵盐类(苯扎氯铵、苯扎溴铵等阳离子表面活性剂)、有机汞类(硫柳汞、硝酸汞)、脒类(氯己定)、醇类(苯甲醇、三氯叔丁醇)、酯类(对羟基苯甲酸)，其代表性化学结构、作用机制及抗菌谱见表1。

在表1所列各类防腐剂中，BAC杀菌力强、水溶性好，稳定性高且不易受保存温度影响。Charnock［2］对比了5种不同品牌人工泪液中5类不同防腐剂的抑菌效力，发现BAC是唯一能够同时有效抑制绿脓杆菌、金色葡萄球菌和白色念珠菌的防腐剂，特别是作为唯一对金色葡萄球菌有效的防腐剂，能够满足《欧洲药典》的要求。

1.4 国内外市场上常用眼用制剂中的防腐剂 相对于国内上市眼用制剂，美国及欧洲对防腐剂的应用有着更为明确的规定，规定其包装标签中必须标明所用抑菌剂种类和含量，且既要求保证所使用抑菌剂应达到最低有效浓度，又规定其含量为标示量的±20%。本院在售进口眼用制剂中防腐剂种类及浓度见表2。

由表2可以看出，国外各大眼用制剂制药厂商多选用的防腐剂为苯扎氯铵(BAC)，浓度范围为0.005% ～0.02%，而我国由于无相关法律规定，国产眼用制剂处方中的防腐剂种类、浓度未能向广大医师、药师及患者提供，产品信息不完善，考虑到防腐剂可能带来的致敏性等一系列日益突出的问题，存在一定安全隐患，且相关研究、报道较少，有关法律法规有待完善。而本院院内制剂中防腐剂则基本以0.03%尼泊金乙酯为主，应用历史悠久，不良反应发生率低，患者耐受性良好。同时，尼泊金酯、苯扎溴铵亦在国产眼用制剂中广泛应用，但尼泊金类有抑菌作用起效慢、抗菌谱窄、对绿脓杆菌作用弱等不足。

表1 国内外常用防腐剂

表2 本院在售眼用制剂中的防腐剂

2 BAC的临床/非临床研究

2.1 BAC的特点 苯扎氯铵为季铵盐类阳离子表面活性剂，分子中含带正电的氮离子及带负电的氯离子，常用浓度为0.004% ～0.025%，作用于微生物的细胞膜或竞争其辅酶，降低其表面张力，增加菌体胞浆膜和细胞器的通透性，使细胞破裂、溶解，从而达到防腐目的。为提高其杀菌和抑菌能力，与0.1%EDTA联用，可使其对葡萄球菌属(G+)、绿脓杆菌(G－)及烟曲霉的活性大大增强。又由于其为氯化(N－烷基－苯基－二甲基)铵，分子中含 C8－C18烷烃，有研究报道［3］称含不同碳原子数的BAC抗菌效力及毒性有所差别，其中C12抗菌活性最好，而C14对角膜上皮毒性最大。BAC对角膜上皮细胞毒性的原因，是由于BAC作为表面活性剂可破坏角膜上皮脂质层，使更多的活性化合物透过，改变细胞通透性所引起的。但这种活性化合物的透过程度，与其自身性质有关。Pellinen等［4］通过对比含BAC及无防腐剂的他氟前列素滴眼液在兔房水中的浓度，并未发现明显差别;而 Rathore［5］和 Majumdar［6］则证实对于阿昔洛韦及大部分抗生素，BAC会提高其对人角膜的透过率。那么这种通透性的改变会不会使滴眼剂的效力，尤其是抗青光眼药物降眼压的效果增强，答案是否定的。临床试验证实［7］，对于β受体拮抗剂的倍他洛尔、卡替洛尔及噻吗洛尔，BAC的存在对于眼内压(IOP)的控制无明显作用。对于含BAC的前列腺素类抗青光眼滴眼液的相关研究，也显示出相似的结果［8］。鉴于BAC对药物治疗效果无明显提高作用，其对眼表毒性及长期接触可能造成的损害则成为医学和药学工作者的研究重点。

2.2 BAC的毒性研究

2.2.1 过敏反应 由防腐剂所引起的过敏症状如结膜充血、流泪、畏光、灼烧或刺痛感等应与环境或治疗药物本身导致的过敏反应加以区分，才能更准确地进行评价。Hong［9］通过检索PubMED和OVID数据库，查得2004—2009年间有关BAC过敏反应的报道占总眼科防腐剂文献的8%左右(preservative与ophthalmology为关键词)。动物实验［10］表明，在兔眼滴加30μl 0.01%BAC，168 h后依然可以检测到，其在角结膜上皮组织的半衰期约为20 h，在结膜深层机构的半衰期约为11 h，又由于BAC会随滴眼液通过内眦鼻泪管从鼻腔黏膜吸收从而进入全身循环，提示医师应注意其引起的眼部和全身迟发型超敏反应(delayed－typehypersensitivity，DTH)。Pauly等［11］推测 BAC 引起过敏的机制与细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)及人白细胞抗原(HLA－DR)表达有关。

2.2.2 干眼症状 BAC对眼表的损害除了使角结膜上皮细胞屏障功能降低外，对泪膜的损害表现在其表面活性剂去垢作用使泪膜脂质层破坏，稳定性降低［12］。Baudouin等［13］通过对比志愿者健康眼表在使用含BAC与无防腐剂滴眼液后的泪膜破裂时间(tear break－up time，TBUT)发现，含防腐剂组TBUT显著降低。Ciancaglini等［14］则利用活体共焦显微镜(in vivo confocal microscopy，IVCM)观察了27位分别滴用含BAC与无防腐剂左布诺洛尔6个月结膜上皮给药前后变化，发现两组杯状细胞密度减少分别为61%与17%，差异显著(P＜0.001)。泪膜功能的损害会加速水分液蒸发，杯状细胞的滑润和保护上皮作用及所含黏蛋白的减少均会改变眼表湿润状态，对于需要长期使用滴眼剂的患者(如青光眼、干眼症患者)，防腐剂所造成的眼表损害必须加以重视，否则会加重病情，产生恶性循环。

2.2.3 体外细胞学研究 分子细胞生物学的发展，使得可以在细胞、分子甚至DNA水平来研究细胞的结构和功能。微量荧光活细胞检测法(MiFALC)及共聚焦显微镜(confocalmicroscopy through focusing，CMTF)等更为微观、直接观察细胞、亚细胞水平形态的技术也被应用于防腐剂对眼表损害的研究中。Debbasch等［15］考查不同浓度BAC下混合培养的人角膜细胞系与人结膜细胞系的存活率，发现BAC的细胞毒性与其浓度呈正相关，毒性阈值为0.005%。Ayaki等［16］发现人角膜上皮细胞系(human corneal endothelial cells，HCECs)在市售含防腐剂滴眼液中暴露48 h存活率仅为20%～30%，而在不含防腐剂的对应药液中为80%，甚至更高。相关研究［17］表明，BAC的致细胞坏死机制与诱导线粒体释放凋亡诱导因子(apoptosis－inducingfactor，AIF)，并通过si－RNA介导下调 beclin－1基因的表达，进而影响细胞自噬作用有关。而细胞印记学及组织学的研究［18］发现，长期使用含防腐剂滴眼液的青光眼患者均呈现结膜组织纤维化及鳞片转化的症状。

2.2.4 其他潜在危害 除上述已被证实的危害外，BAC对小梁网、晶状体甚至眼底也存有潜在的危害。有报道［19］称，长期应用含防腐剂降眼压滴眼剂的青光眼患者，其小梁网滤过手术的成功率会大大降低。国外某研究机构［20］对应用含防腐剂滴眼液治疗5年以上的青光眼患者做了评估，其白内障并发几率高于未治疗组，究其原因，可能与BAC刺激产生的炎症促进了前列腺素－E2、白细胞介素－1α及白细胞介素－6的表达有关，从而加速了晶状体浊化过程。还有报道称，防腐剂会引发白内障术后囊样黄斑水肿，Miyake等［21］则就此现象，提出了“人工晶状体的防腐性黄斑病变”(pseudophakic preservativemaculopathy)这一术语。

2.3 临床观察 人体内临床试验也证实，对于长期使用滴眼剂的患者，减少防腐剂所带来的负面影响，可改善患者生活质量，同时增加患者对药物治疗的耐受性。在一项单盲临床实验中，Campagna［22］对比了更换使用无防腐剂滴眼液3个月后发现患者的眼表黏液细胞显著增加，结膜上皮细胞损伤明显恢复，入组时所具有的刺激感、异物感等主观症状消失。与此类似，一项多中心开放临床实验［23］所入组的158名患者中，在更换无防腐剂滴眼液治疗2周后，灼烧感及干眼症状明显减轻，泪膜破裂时间增加。

2.4 小结 一直以来，医药研究工作者对BAC等防腐剂的研究从来没有间断，而对防腐剂所造成损害的认识也愈来愈深刻并达成共识，针对其可能造成的伤害制定了各种有效防范措施。其中包括对青光眼患者、干眼症患者、Lasik术后以及各种眼科手术中所应用的眼用制剂应避免使用含防腐剂滴眼液，以及用于治疗干眼症的滴眼液改为单剂量包装等。但上述措施在现实中实行起来难度很大，或者大大增加患者的经济成本，而近年来已经实施了一些简单而行之有效的措施，简要介绍如下。

3 解决方案

3.1 高效低毒的新防腐剂的开发 各大制药厂商长久以来一直致力于研发高效低毒的新型防腐剂，其目标既要有足够强的抑菌、杀菌能力，又要求对眼表或人体器官低毒乃至无毒性。Allergan公司的Noecker［24］及其同事发明了商品名为Purite®的新型氯氧化合物(stabilized oxychloro complex，SOC)防腐剂，其有效成分为亚氯酸钠，在紫外线照射后分解为Cl－和水，并成功应用到酒石酸溴莫尼定滴眼液(Alphagan P®)中。通过实验对比［25］，不但发现其相对于BAC的低毒性，更由于可增加溴莫尼定在房水中的浓度，使Alphagan P®中溴莫尼定的浓度从0.2%降至0.15%，使产品成本大大降低。同样，Alcon公司则发明了商品名sofZia®的眼用防腐剂［26］，是由锌离子、高硼酸根、丙二醇及山梨醇组成的缓冲液，与泪液接触后降解为氧气和水，其抑菌性满足美国药典标准，以sofZia®作为防腐剂的曲伏前列素(Travatan Z®)于 2009年在美国上市，临床试验［27］证实，与含0.02%BAC的上市品种具有相同的降眼压能力，且更为安全，更换滴用含sofZia®的曲伏前列素8周后，TBUT 从(2.02 ±0.71)s增加到(6.34 ±1.31)s，角膜染色及眼表面疾病指数(ocular surface disease index，OSDI)均显著下降(P＜0.001)。而表2中提及的POLYQUAD®多用于隐形眼镜护理液［28］，除杀菌抗感染外还有防蛋白沉积，去除蛋白沉淀等作用，安全性高，对眼部耐受性好。

3.2 新剂型及新给药载体 对于多剂量包装的滴眼液，为避免长期使用带来的眼表损害，不添加防腐剂是否可行，Rahman等［29］通过收集95个住院、门诊患者分别使用3、7 d后不含防腐剂的多剂量包装滴眼液，对其以不同培养基培养并鉴定，发现其中8瓶有明显细菌生成，共包含7个菌种，其中金黄色葡萄球菌最为普遍。Kim等［30］则考查了含防腐剂与不含防腐剂的人工泪液在10 h内使用3次或更多后的染菌率，发现无防腐剂组染菌率为5/207(4株凝固酶阴性葡萄球菌，1株革兰阴性不动杆菌)，含防腐剂组则为0/35，最大感染源为手指接触。上述结果均表明不含防腐剂的多剂量包装滴眼液在使用过程中存在高污染风险。鉴于此，通过减少使用频率，降低防腐剂所带来危害的长效滴眼剂已经被研发，如长效噻吗洛尔给药频率由2次/d降至1次/d，可减少防腐剂毒性接触50%。近年来，前列腺素类、碳酸酐酶抑制剂类和复方溴莫尼定的长效剂型已被开发并应用于临床。

针对眼表损害已非常严重或对防腐剂耐受量极低甚至过敏的青光眼病人，法国Laboratoires Théa公司发明了名为ABAK®的给药装置，在多剂量包装滴管后端加入0.2μm滤膜及滤芯装置，防止药液回吸及从外界带入的细菌感染瓶内药液，从而达到无防腐剂添加又能抑菌的目的，该装置可盛纳300滴药液，相当于150支单剂量包装，无论从经济上还是使用上均带来极大便利。美国辉瑞公司则发明了名为“preservative－free sterile fluid dispensing system”的专利(Patent No:5，310，094)，应用于多剂量包装滴眼剂，同样可避免药液回流带入的污染。

3.3 高分子聚合物的保护作用 近年科学研究表明，许多高分子聚合物不但对上皮细胞无毒性作用，而且还由于具有抗氧化性，对防腐剂或促渗透剂造成的人角膜上皮细胞的DNA损伤具有保护作用。Paulion等［31］通过体外实验证实了分子量1000KDa的透明质酸(hyaluronan，HA)能够显著降低BAC所致的人角膜上皮细胞的氧化应激与细胞凋亡和坏死，而20KDa和100KDa的HA则无此功能。Ye［32］则通过自制的壳聚糖基生物材料组织工程化角膜细胞载体的研究，发现了其对角膜上皮层及内皮层损伤的原位修复作用。一项关于丝胶(sericin)的最新研究［33］表明，在含0.005%BAC的马来酸噻吗洛尔滴眼液中加入0.1%丝胶后，能够显著降低BAC对角膜造成的伤害，表现为角膜伤口愈合速率常数(cornealwound healing rate constants，kH)大大高于只含BAC的滴眼液，且与后者具有相同的控制眼内压及抑菌效力。

3.4 自身防腐 其原理在于本身具有抗菌作用的药物成分在滴眼液储藏、运输、使用过程中，充当了防腐剂的功能，现阶段可行的药物主要包括第三代和第四代喹诺酮类滴眼液(浓度0.3% ～1.5%)，目前，在美国和日本已有上市，在中国2010年版药典中虽有所提及，但未做明确规定。

4 结论与展望

防腐剂在眼用制剂中的应用已有近百年的历史，其作用无疑是一把双刃剑，也越来越受到人们的重视。而国产制剂中无论在防腐剂品种选择还是相关研究上，均与国外有较大差距。为了确保眼用制剂对患者的治疗安全有效，广大眼科医药工作者还有大量工作要做。

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