螺内酯对原发性SHR 心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响

赵 红 ，顾定伟，焦万玲，黄宇玲，刘培光，赵丽娜，于海艳

(1.天津医科大学第二医院，天津 300211;2.河北联合大学附属医院，河北 唐山 063000;3.唐山市丰润区中医医院，河北 唐山 064000)

心脏是原发性高血压直接受累的靶器官，常表现为心肌肥厚、心肌纤维化、心肌组织及离子通道的重塑。目前，对于原发性高血压病的治疗主要采用药物改善高血压心肌胶原沉积，以及控制心肌纤维化的发生发展进程，保护靶器官。实验研究显示，非选择性醛固酮受体拮抗剂螺内酯能下调纤维母细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达［3］，改善原发性高血压大鼠心肌肥厚及胶原的沉积［4-5］，下调心肌梗死大鼠Ⅰ、Ⅲ胶原mRNA 的表达［6］。临床研究显示［7-8］，螺内酯可改善心衰症状，减少心肌梗死后及扩张型心肌病患者Ⅰ、Ⅲ胶原合成的血清标志物。但血清标志物及mRNA 水平不能完全代表心肌组织局部胶原蛋白水平。因此，本研究以原发性高血压大鼠(spontaneously hypertension rat，SHR)为研究对象，观察非选择性醛固酮受体拮抗剂螺内酯对原发性高血压心肌纤维化进展期心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响，探讨螺内酯抗高血压心肌纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性7 周龄SHR 20只，体重120～150 g，购自中国医学科学院实验动物研究所。雄性7 周龄Wistar-kyoto 鼠7 只(WKY组)，体重120～150 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。SHR 随机分为两组:螺内酯组(10 只)和对照组(10 只)。实验大鼠普通饲料喂养1 周，第8 周龄开始，螺内酯组SHR 每天给予螺内酯20 mg/kg，双蒸水溶解灌胃，对照组SHR 和WKY组大鼠在同一时间同容量双蒸水灌胃。每周测大鼠体重，随体重增加调整给药量，连续16 周，饲养在恒温、恒湿、人工光照明暗各12 h 的安静饲养室内。

1.2 标本采取 三组大鼠满24 周龄，测量体重，20%乌拉坦1 g/kg 腹腔内注射麻醉，迅速打开胸腔，取出心脏，用预冷的生理盐水充分灌洗，滤纸吸干，沿房室环减去房室游离壁和右室游离壁，分离出左心室，用锋利手术刀自左心室心底部至心尖部横断为2 片，做好标记。其中1 片立即投入液氮罐中，用于Ⅰ型胶原Western blot 的检测;第2 片立即置入10%中性甲醛固定液中，用于组织形态学观察。

1.3 主要试剂 十二烷基硫酸钠、Tris baseβ、巯基乙醇、丙烯酰胺、N，N'-亚甲双丙烯酰胺由中国医学科学院血研所科技公司进口分装;考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、Sirius Red为Sigma 公司产品;溴酚蓝购自生工生物工程有限公司;兔抗胎鼠皮肤Ⅰ型胶原单克隆抗体购自CALBOCHEM 公司;预染蛋白分子量标准购自Fermentas 公司;鼠抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自康成生物工程有限公司。

1.4 天狼猩红-苦味酸染色 心肌组织采用10%中性甲醛固定24 h，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，厚度5μm。天青石蓝液10 min，蒸馏水冲洗3次，每次5 min;天狼猩红饱和苦味酸染色30 min，无水乙醇分化30 s，二甲苯透明光学树胶封固。天狼猩红染色在光镜下细胞核呈绿色，胶原呈红色，其它成分呈黄色;在偏振光显微镜下，Ⅰ型胶原纤维呈红色和黄色，Ⅲ型胶原呈绿色的细纤维。采用Nikon E600POL 偏振光显微镜Pixerra Penguin 150ES CCD2Image Pro Plus 5.5 图像分析系统，计算Ⅰ、Ⅲ型胶原面积，用像素数表示。Ⅰ/Ⅲ胶原比值=Ⅰ型胶原总面积/Ⅲ型胶原总面积。

1.5 心肌组织Ⅰ型胶原Western blot 检测 精确称取三组大鼠心肌组织100 mg，PBS 洗净，剪碎至1 mm 大小，1 ml 0.5 mol/L 冰乙酸膨胀过夜，4℃匀浆，10 000 r/min 离心25 min，加入胃蛋白酶，4℃消化搅拌6 h，加入Tris 至pH 7.4 终止酶解。Bradford 法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE 和Western blot 参照二版分子克隆，加样量为25μl，GAPDH 作为内参，ECL 试剂盒显影。计算机自动图像分析软件系统对条带所在面积进行Ⅰ型胶原灰度累积分析，并与内参条带灰度进行校对作为最后结果(Ⅰ型胶原灰度/GAPDH 灰度)。

1.6 统计学方法 使用SPSS 10.0 统计软件程序处理，实验结果以表示，不同组间数值比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，P＜0.05 为差异有显著性统计学意义。

2 结果

在实验过程中螺内酯组和对照组大鼠各死亡1 只。

2.1 免疫印迹法测定螺内酯对SHR 心肌组织Ⅰ型胶原水平的影响 与WKY组比较，对照组心肌Ⅰ型胶原明显升高(P＜0.05);治疗16周，与对照组比较，螺内酯组左心室Ⅰ型胶原含量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05，表1，图1)。

2.2 偏振光显微镜观察螺内酯对SHR 左室心肌Ⅰ、胶原像素积分及Ⅰ/Ⅲ比值影响 与WKY组比较，对照组心肌Ⅰ型胶原像素及Ⅰ/Ⅲ比值升高(P＜0.05);与对照组比较，螺内酯组Ⅰ型胶原像素减少，Ⅰ/Ⅲ比值下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，但三组间Ⅲ型胶原未见明显差异。见表1，图2。

图1 三组大鼠左心室心肌Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹放射自显影Fig.1 Western blot results of collagen type Ⅰin left ventricular among the three groups

表1 Western blot 及偏振光显微镜观察3组大鼠左室心肌Ⅰ、Ⅲ胶原及Ⅰ/Ⅲ比值Table 1 The levels of collagen type Ⅰ，Ⅲ and Ⅰ/Ⅲ ratio by Western blot and polatized light microscopy

图2 三组大鼠左室天狼猩红染色心肌组织学Fig.2 Histopathology of left ventricular in the three groups by sirius red stain

3 讨论

SHR 是一种慢性高血压模型。实验显示［9］，SHR 在6 周时血压开始增高，但不稳定，血管周围纤维化已经出现，但无心肌间质纤维化;14 周时血压持续增加，心肌羟脯氨酸含量增高，称为增高期。24 周血压趋于稳定，心肌间质纤维化明显增加。本研究为观察螺内酯对原发性高血压进展期心肌胶原的影响，因此选用8 周龄SHR 作为实验起点治疗16 周，24 周龄为实验终点。

螺内酯为非选择性醛固酮受体拮抗剂，其男性乳房女性化和性功能障碍的副反应随剂量增大而增加;有研究发现［1］，12.5～25.0 mg/d螺内酯对血液动力学无明显影响，但能有效阻断醛固酮受体，当每日用量大于50.0 mg 时可产生高血钾。目前该药临床除用于调节体液代谢外，常规用量多为每天12.5～25.0 mg［11］。为此，本实验参照临床用量，选用螺内酯为20 mg/(kg·d)。与血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)不同，螺内酯可抑制22个月正常大鼠心肌纤维化的发生，具有抵抗大龄和老化所致的心脏退行性改变［12］，而ACEI 药物没有这样的作用，因此对于螺内酯抗心肌纤维化机制越来越多地受到人们的关注。

心肌组织间质主要由Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原组成。高血压组织病理学主要表现为心肌肥厚及Ⅰ型胶原沉积，同时存在胶原种类和分布的改变，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值增加［13］。由于Ⅰ型胶原相对粗大，在抗张力作用及维持心室形态中发挥作用，在静止的心脏内需要100 mmHg 以上的压力才能抵抗胶原的作用使室壁膨胀［14］。而Ⅲ型胶原分子纤细，在心肌的延展和回弹特性中发挥重要作用。左室的舒张包括早期的快速充盈期，是心肌主动松弛的过程，而晚期的被动充盈期，依赖于心肌的弹性指数。

本研究结果显示，螺内酯减少SHR 心肌组织Ⅰ型胶原的数量，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值下降，对Ⅲ型胶原无明显影响。采用天狼星红染色，偏振光显微镜观察心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原及Ⅰ/Ⅲ型胶原比值，普通光镜观察胶原纤维呈红色，细胞核呈绿色，其它成分呈黄色。在偏振光显微镜下，Ⅰ型胶原纤维呈红色，排列紧密;Ⅲ型胶原呈绿色的细纤维，能在同一张玻片上同时显示Ⅰ型和Ⅲ型胶原［15］。另外，成纤维细胞内，胶原基因转录为mRNA，翻译出的肽链经羟化、糖基化形成前胶原，前胶原在细胞外还需相应酶切去前体序列并进行交联反应形成原胶原，最后聚合成胶原纤维。因此，研究螺内酯对原发性高血压心肌组织结构影响，特别是胶原种类和分布及其调节机制具有重要意义。

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