体细胞突变与个性化靶向治疗新思路

陈枢青

(浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所，浙江 杭州 310058)

人类对基因的认识大致可以分为三个阶段。第一阶段为生物学基础研究阶段，其关注的重点在于不同物种的基因结构，同类基因的同源性和功能差异，以及从基因水平梳理物种进化路线和迁移路线。第二阶段为遗传背景研究阶段，关注的重点在于人类不同个体之间在基因水平上的微小差异所造成的个体在遗传表型上的差异，如肤色、身高、性格、特长、疾病易感性、药物作用个体差异等，确立了基因多态性等重要概念，建立了一批遗传病的诊断方法，探索了一些遗传易感性疾病的风险预测理念。第三阶段为临床个体化医学转化阶段，关注的重点深入到体细胞突变是疾病发生发展的机制，是诊断治疗疾病的钥匙。从而产生了许多新的概念和观点，如肇事突变和无关突变、突变发生的热点部位和造成疾病的重点部位、基因治疗的靶突变、突变蛋白质才是肿瘤特异性蛋白质、肿瘤的免疫治疗和基因治疗等。现就初露端倪的第三阶段的进展作一介绍。

1 基因多态性决定了个体的疾病易感性，而体细胞突变直接导致了疾病的发生发展

随着人类基因组计划的完成，人类进入了后基因组时代，彻底阐述基因组编码蛋白的功能，搞清DNA序列中所包含的信息是摆在人类面前的一项极具挑战性的使命。大量的研究表明，基因与癌症、早老性痴呆、糖尿病、高血压等疾病有关。事实上，近20年来人们更多地在分子水平上研究DNA突变(RFLP、SSLP、SNP等)与疾病之间的联系，试图证明疾病是由于遗传决定的，却在某种程度上忽视了环境因素对人体生理活动的影响。尽管遗传是疾病发生的重要因素，但是对于某种特定疾病，发挥直接作用的却是后天的体细胞突变，不同个体所具有的体细胞突变必然不同。这些突变之间相互作用，并与环境和生活方式相互影响，加大了研究基因和疾病之间关系的难度。由于全基因组测序的高成本和海量基因信息极难处理，限制了人们在基因组水平上将疾病进行细致分类的研究。因此，目前所谓的个性化治疗大多只是根据“人”的个性化，很少涉及“病”的个性化。直到最近几年，由于全基因组测序成本大幅度降低，这个领域的前景才初露端倪。

体细胞突变发生的机制基本是两种情况:其一，细胞在正常分裂时半保留复制过程中自发的少量配对错误，而细胞的自身修复机制未能发现并予以及时纠正，因此被保留进入子代细胞;其二，环境物质对DNA攻击发生碱基改变而生成体细胞突变，随着进一步的细胞分裂进入子代细胞。人类从父母得到的遗传物质也存在突变，但这些突变多数被称为基因多态性，它是人类长期进化过程中随着生殖细胞突变而分布在广大人群中的突变，因此在人群中存在一定的突变比例。目前学术界一般认为只有在人群中大于1%发生率的突变可被称为单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。SNP决定了个体的体质，也就是在人与环境接触过程中个体保护自身DNA不发生体细胞突变的能力，常称为疾病易感性。而体细胞突变决定了疾病在实际发生发展过程中的实质。

人体由60兆左右的细胞组成，每个细胞在其生命进程中都会进行多次的复制，尽管复制过程中，机体存在多种机制保证复制的高保真性，但是还是有部分DNA会发生突变，而这一突变产生的结果可能是决定性的。在大多数散发性肿瘤生长的早期，突变发生形成选择性优势，引起肿瘤细胞疯狂增长。由于人体本身的复杂性，这方面的研究大多通过比较病例——对照研究中的病例和对照之间的差异，找出SNP等遗传因素差异，指导疾病预防和治疗。考虑到其它因素的影响，不同的研究者可能会得到不同的结论，引起争议。以GSTM1为例，临床研究指出，GSTM1缺失可能和癌症发生率的升高有关;但是，另外一些研究表明，完整GSTM1基因的存在可能对细胞发生的损害［1］和DNA加合物的生成［2-3］有保护作用。因此，以往的研究更关注个体先天的基因多态性对疾病易感性的决定作用。研究者虽然知道先天的基因多态性决定的主要是个体对环境物质攻击DNA时的保护作用，而发生在基因上的体细胞突变才是疾病发生发展的真正原因;但是，限于研究手段只能对DNA加合物的检测分析，很难直接涉及体细胞突变的情况，甚至很多学者忽视体细胞突变的存在。他们认为，如果存在体细胞突变，那么DNA指纹技术还能用于个体鉴别吗?这个问题困惑学术界很多年。相信，随着近年测序技术的快速发展，对同一个体的不同组织进行全基因组测序时，这其中的奥秘定能揭示。

2 自身不同组织的基因序列比对可以检测体细胞突变的位点

2010年，英国剑桥桑格实验中心在《Nature》发表了2篇重要论文［4-5］，一篇对属于同一个体的肺癌细胞和皮肤细胞进行了全序列测定，比较发现肺癌细胞存在22910 个突变;另一篇描述了黑色素瘤细胞与来自同一个体的淋巴细胞的全序列结果，比较发现了33345 个突变。他们提出虽然有上万的体细胞突变，只有小部分是肇事突变(driver mutation)，大部分是与疾病发生发展无关的无关突变(passenger mutation)。之后的2年多，这个领域的研究如雨后春笋，脑瘤、白血病、卵巢癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、肝癌、肾癌、肺癌［6-12］等都完成了肿瘤细胞与正常细胞的同个体对照全基因组测序，发现的体细胞突变数量基本在几万这样一个区间。这正好回答了让学术界困惑多年的问题:体细胞突变确实存在，只是有限的数量与基因组总量相比是很小的比例，虽然其不影响个体鉴别，却实实在在是引起疾病的元凶。

人一生长期与环境互相作用，有些DNA首先发生体细胞突变，这个突变位点会在其分裂生成的子代细胞中得到遗传，被称为体细胞遗传。不断的突变，不断的细胞分裂，体细胞突变会在细胞中积累，年龄越大积累的体细胞突变越多，造成组织内部细胞拥有一群一群的单克隆。2011年，Gaisa等［13］对膀胱上皮细胞进行了研究，发现其拥有多个单克隆族群。每一个族群内部拥有相同的基因序列，而族群之间在某些基因上可发现独特的体细胞突变特征。Kan等［14］的研究显示，肿瘤的体细胞突变在患者中具有多样性，并带来了发生发展过程中的差异;同时发现，体细胞突变虽然发生在同一个基因上，却分散在不同的位置，说明体细胞发生的随机性。Si等［15］对432例中国黑色素瘤患者进行了BRAF和NRAS的基因测序，发现基因上有些位置如BRAF V600E是高频突变位点，称为突变热点(hot spots)，有89个样本在这个位点有突变。而其他多数体细胞突变却只在1个样本中检测得到，更说明了体细胞突变的随机分布性质。Morin等［16］对非霍奇金淋巴瘤的研究中也发现，在组蛋白修饰基因上的高频率体细胞突变。2012年，Hodis等［17］对大规模黑色素瘤的外显子数据进行分析，结果发现了6个异常的黑色素瘤相关基因(PPP6C、RAC1、SNX31、TACC1、STK19 和 ARID2)，其中RAC1、PPP6C和 STK19基因拥有频发性。这种肇事突变组合的研究为黑色素瘤形成过程中紫外线的直接诱变作用提供了明确的基因组学证据。Stephens等［19］对100个乳腺癌样本进行了全基因测序，发现肿瘤样本之间在体细胞突变的分布上差异性很大，还发现患者年龄越大，体细胞突变的数量越多。这个现象符合体细胞发生的随机性和在子代细胞中积累的特性。通过对大量测序结果中肇事突变的分析，发现了9个乳腺癌相关的基因AKT2、ARID1B、CASP8、CDKN1B、MAP3K1、MAP3K13、NCOR1、SMARCD1和 TBX3。

上述研究结果说明，对于一个细胞来说肇事突变或肇事突变组合的形成是一个偶然事件，一旦发生会让细胞发生异化。异化了的细胞如果能够遵循体内“细胞社会”的规则，就会选择凋亡，从而个体组织正常发展。如果异化细胞逃脱凋亡以及体内免疫监视，则形成异常细胞群，进而影响组织、器官，发生疾病。很多疾病如肿瘤、糖尿病、高血压和阿尔茨海默病等都有这样的一个发生发展的过程。

3 靶向药物的个性化方案是治愈难治性疾病的钥匙

难治性疾病如肿瘤、高血压、糖尿病等，都有症状表现相似而发病机制完全个性化的特点。目前开发新药做临床试验时，这类疾病的新药有效率总体不高，原因不是这些新药有效性差，而是参与新药试验的患者疾病类型多样，有些疾病类型尚未知晓。因此，新药针对的患者表现出疗效，不针对的患者无效。随着疾病机制研究的深入，很多用于开发新药的靶标被发现。根据这些靶标理性设计的新药除了毒性难于预测外，有效性还是有把握的。目前，靶向新药越来越有针对性，这样就要求研究者从临床试验到实际使用，都应该细分患者与疾病的类型。以往的个性化医疗，重点表现在对患者的个性化，如年龄、性别、有否吸烟等外在因素，以及靶标基因多态性和代谢分布基因多态性等内在因素。而根据体细胞突变原理设计的药物使用个性化，更注重针对疾病细胞的体细胞突变多样性。

2010 年，Alberto 和 Atanasio［19］强调肿瘤细胞本身的基因组学改变是决定肿瘤个性化治疗中的重要因素。梳理了大量已经上市和正在研究中的靶向药物，提出这些药物的正确使用，必须建立在肿瘤基因组信息的分析基础之上。将来对难治性肿瘤的治疗方案应该是根据肿瘤细胞的基因组特点，复方使用多个靶向药物，杀死全部肿瘤细胞。2011年，Picker和 Jackson［20］梳理了肿瘤治疗中的个体化因素，首先是先天的基因多态性决定了个体对药物处置上的差异，如药物代谢酶的基因多态性、药物转运体的基因多态性等;然后是后天的肿瘤细胞上的体细胞突变，决定了肿瘤的类型及其对药物的敏感性和耐药性。2011年，Swords等［21］分析了针对白血病的个性化医疗，主要思想也是根据肿瘤细胞的体细胞突变结合表达谱的改变，制订个性化治疗方案。2011年，Dienstmann等［22］评估了在小细胞肺癌治疗中肿瘤细胞的体细胞突变测定对临床治疗效果的贡献。2012年8月，Muller等［23］提出了无关体细胞突变也是可以用于肿瘤个性化治疗的思路。2012年Iyer等［24］对膀胱癌患者的肿瘤细胞进行了全基因组测序，找到了17136 个体细胞突变;经分析发现，其TSC1基因有一个丢失了2个核苷酸的体细胞突变，这个突变造成读码位移，从而提高了患者对靶向mTORC1新药Everolimus的敏感性。

综上，①不同的肿瘤有着不同的体细胞突变;②即使是同样的肿瘤临床类型，不同个体有不同的体细胞突变;③大量个体样本的测序结果可以用来归纳哪些是肇事突变，哪些是无关突变;④肇事突变的确认可以用于肿瘤发生发展机制的研究;⑤体细胞突变类型才是肿瘤分类的真正和实用的依据;⑥无论是肇事突变还是无关突变都可能是个性化治疗肿瘤的生物标志物;⑦上述研究主要涉及肿瘤，其实常见的难治性疾病，如高血压、糖尿病等都有类似的体细胞突变的积累导致疾病的发生发展的过程。因此，可以预见在不远的将来，基因测序会变成常规性的临床检测技术，对人生不同时期、不同组织样本全基因组测序会提供个体健康状况的信息，更会对目前的难治性疾病制订有效的个性化治疗方案。

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