增液布津汤对干燥综合征模型鼠颌下腺AQP5表达的影响

金桂兰，何慧珍

(南京中医药大学，南京 210046)

干燥综合征(Siccasyndrome，SS)又名斯耶格伦综合征(Sjoren’S syndrome，SS)，是一种主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫性疾病。以淋巴细胞介导的病变主要侵犯泪腺和大小唾液腺等外分泌腺，导致腺体破坏和分泌减少，同时可累及全身多个系统组织，引起内脏损害。近年来有学者证实，水分子通道蛋白-5(aquaporins-5，AQP5)与涎腺的分布以及腺泡细胞的转运异常密切相关［1］。研究发现，AQP5亦存在于角膜上皮和泪腺中［2］，可见唾液、泪液的分泌均与其有关。本文从AQP5角度探究“养阴益气、布津通络法”治疗SS的机理，为SS的治疗提供靶点，有助于从细胞分子水平明确SS的发病机制。

1 材料

1.1 动物

清洁级雌性 SD大鼠，体质量 220g～250g;BALb/C雌性小鼠60只，10周龄，体质量20g～22g左右(苏州爱尔麦特科技有限公司提供，动物合格证号SCXK(苏)2009-0001号)。

1.2 药物

增液布津汤(由黄芪 20g、麦冬 20g、太子参10g、枸杞子 10g、生地 15g、赤白芍各 10g、桃仁 10g和紫菀10g组成，购自南京中医药大学附属医院门诊部)加入8～10倍水浸泡1 h，煎煮2次，每次煎煮40min合并滤液，水浴蒸发浓缩(每毫升含生药1.365g)置于4℃冰箱保存备用。环戊硫酮片(山东博士伦福瑞达制药有限公司提供，每片25mg)25mg溶于50ml蒸馏水中，配制成0.5mg/ml的药液，4℃冰箱中保存备用。

1.3 试剂

弗氏完全佐剂(Sigma公司，LOT:129K8700);考马斯亮蓝(G250，RαD公司进口分装，批号911010);吸附无细胞百日咳、白喉、破伤风联合疫苗，武汉生物制品研究所，批号091147-4);卡介苗(BCG，上海生物制品研究所，批号09061301);小牛血清(BSA，杭州四季青生物公司，批号080517);AQP5抗体(购自美国Santa Cruz公司);二抗(羊抗兔二抗，购自上海博奥森公司);PMSF(苯甲基磺酰氟，购自南京生兴生物技术公司);丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、SDS(十二烷基磺酸钠)、β-巯基乙醇、Glycine(甘氨酸)、Tris-base、溴酚蓝、TEMED(四甲基二乙胺)、AP(过硫酸胺)(均购自 Sigma公司，北京夏斯生物技术公司分装);Western blotting electrochemiluminescence(ECL，购自 Amersham 公司);硝酸纤维膜(NC，购自 Amersham公司);脱脂奶粉(光明公司);蛋白定量试剂盒(购自 BIO-RAD公司)。

1.4 实验仪器

SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司);5810R型低温超速离心机(德国EPPENDORE公司);XHF-1高速匀浆器(上海金达生化仪器厂);JA1203型电子天平(上海天平仪器厂);MAX 190型酶标仪(美国AD公司);ELISA试剂盒(RαD公司分装);医用X光片(购自Kodak公司);Power Pac Basic电泳仪(购自BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 SS小鼠模型制作及分组给药

取BALB/C小鼠60只随机分为6组:正常对照组(生理盐水 20 ml·kg－1)，模型组(生理盐水 20 ml·kg－1)，增液布津汤低剂量组(6.8g·kg－1)，增液布津汤中剂量组(13.6g·kg－1)，增液布津汤高剂量组(27.3g·kg－1)，环戊硫酮组(1.25g·kg－1)。取5只SD大鼠颌下腺，分离包膜及结缔组织，剔除淋巴结，每0.1 g置入10ml无菌试管中，加氯化钠注射液2ml，在冰浴中用匀浆器匀浆，再在4℃低温离心机中离心。离心后利用考马斯亮蓝比色法测定其蛋白含量。根据预实验及参考文献［3］，将该上清液加入灭菌生理盐水中稀释成0.4g·L1的上清液，再与弗氏完全佐剂混合，制备终浓度为0.2g·L－1乳化抗原液。于小鼠两后脚掌及两侧腹股沟sc乳化抗原，每只 0.2 ml(含卡介苗 3.75g·L－1)，同时 sc白喉-百日咳-破伤风三联疫苗，每只0.1ml。首次免疫后第3、7天，用乳化抗原对模型组和用药组加强免疫，剂量0.2ml，多点背部 sc。以后每隔14d用乳化抗原加强免疫1次，剂量同首次，共加强免疫2次，多点背部 sc，正常对照组不作任何处理。于免疫后当天开始灌胃增液布津汤，剂量分别为:增液布津汤低剂量组(ZYBJⅠ6.8g·kg－1)，中剂量组(ZYBJⅡ13.6g·kg－1)，高剂量组(ZYBJⅢ27.3g·kg－1)，环戊硫酮组(12.5mg·kg－1)，正常对照组(生理盐水 20ml·kg－1，模型组对照组(生理盐水20ml·kg－1)。以上各组每日灌胃1次，连续5d，停药2d，第50天眼球放血处死，立即取一侧颌下腺，置于-70℃冰箱中用于Western blot分析AQP5表达量的变化。

2.2 唾液流量的测定

于免疫后第 10、20、30、40、50 天分别测定给药后小鼠唾液分泌量。测量前禁食1 h，不禁水。将无菌脱脂棉球制成干重5mg的棉球。测唾液分泌时将已经称好干重的棉球放入小鼠后颊部，3min后取出，电子天平上称湿重。唾液分泌量(mg)=棉球湿重－棉球干重。

2.3 镜下观察颌下腺病理变化

实验结束第50天时眼眶取血，处死小鼠立即取一侧颌下腺经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，HE染色。

2.4 Western印迹分析

2.4.1 组织总蛋白提取 (1)取出-70℃冰箱中的标本，称取各组标本500mg，将组织置于2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎;(2)加400ul单去污剂裂解液(含 PMSF)于匀浆器中，进行匀浆。裂解30min后，即用移液器将裂解液移至1.5ml离心管，然后在 4℃下 12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于 －20℃保存。

2.4.2 Bradford方法定量蛋白浓度 (1)将标准蛋白稀释为以下6个浓度(mg/ml):0.02、0.05、0.10、0.20、0.40 和 0.80，各 取 2、5、10、20、40、80μL，再加入buffer和双蒸水(ddH2O)，使总体积为150μL;Sample为 20 倍稀释，取 20μL，加入 130μL双蒸水(ddH2O)，常温作用20min;(2)各孔加入150μL经 3倍稀释的蛋白定量试剂(Coomassie Protein Reagent)，共 300μL反应溶液，室温下作用10min。酶标仪550nm处测得吸光度。以蛋白标准浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作曲线(利用Excel绘制回归曲线)，得线性回归方程:Y=0.8004X+0.5398，R2=0.9737，将测定 OD 值代入方程式，计算蛋白质浓度;(3)测样本浓度:将待测标本吸光度值在标准曲线上查出其对应的浓度，乘以适当稀释倍数即为样本浓度。

2.4.3 免疫印迹测定方法及步骤 (1)样品按比例加入6×上样缓冲液，100℃加热5min使蛋白变性;(2)根据蛋白定量结果上样，使最终上样总蛋白为60μg。取适量处理后的样品完全加入上样孔。Tris-Glycine电泳缓冲液以100V恒压电泳，至溴酚兰到电泳槽最下端;(3)卸下电泳装置，撬开玻璃板取下凝胶;(4)将凝胶进行转膜(湿转)，以95mA电压转膜75min，将分离的蛋白条转移至硝酸纤维素膜上;(5)蛋白质标记:一抗孵育:用 PBS-T(PBS，0.05%Tween-20)洗膜 2次，5min/次。使用阻断剂(无菌PBS中含5%脱脂牛奶)37℃孵育1h，阻断硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点。置于1∶1000(或按抗体生产厂家建议的稀释度)稀释的特异性抗体反应液(无菌 PBS，抗体，1%脱脂牛奶)，放在脱色摇床上，4℃过夜;(6)二抗孵育:弃一抗，用PBS-T洗膜2次，5min/次，去除多余的一抗反应液和非特异性吸附的抗体。加入含1∶5000稀释的过氧化物酶联二抗反应液(无菌PBS，抗体，1%脱脂牛奶)，37℃摇动，孵育2h;(7)曝片:PBS-T洗膜3次，5min/次。加ECL-plus发光显色液，室温作用1min后暗盒曝片。显影之后根据Western Blot彩色标准电泳指示条带(Marker)的位置，分析所测电泳条带的性质。以GAPDH作为内参。电泳条带经Image J软件处理，分析各实验组条带与对照组条带面积、灰度比值，进一步用SPSS 15.0软件进行统计分析。

2.5 统计方法

实验数据均用SPSS 15.0统计软件包进行统计学处理。计量资料用均数±标准差(珋x±s)表示，采用多组重复测量设计资料的方差分析，若方差不齐用秩和检验。设P＜0.05为有统计学意义的界值，以P＜0.05和 P＜0.01分别表示差异显著和非常显著。

3 结果

3.1 各组小鼠唾液量变化比较

表1显示，实验过程中动态测定各组小鼠唾液流量的变化:(1)实验第10～20天各组模型小鼠唾液流量间差异无统计学意义(P＞0.05);(2)从第30天开始与正常对照组比较，模型组小鼠唾液流量明显减少(P＜0.01);与模型组比较，中药中、高剂量组小鼠唾液流量明显增加(P＜0.05);(3)第50天与正常对照组比较，模型组、中药低剂量组小鼠唾液流量明显减少(P＜0.01，P＜0.05);与模型组比较，中药各剂量组、环戊硫酮组小鼠唾液流量明显增加(P＜0.01)。

表1 增液布津汤对SS模型小鼠唾液流量的影响(珋x±s，n=10)

3.2 光镜观察颌下腺病理变化

图1显示，正常对照组颌下腺呈分叶状，腺泡大小规则，排列紧密，腺泡上皮和导管未见变性、坏死，间质未见充血及淋巴细胞浸润等病理变化。模型组大部分可见腺体中度萎缩，腺泡大小不等，数量减少，上皮变性、坏死，导管扩张，腺泡周围中重度淋巴细胞浸润。而增液布津汤中，高剂量及环戊硫酮组腺体萎缩程度减轻，腺泡排列紧密，腺泡上皮轻度变性、坏死，导管轻度扩张，腺泡周围组织有轻度淋巴细胞浸润，尤其是高剂量组仅见个别淋巴细胞浸润，腺泡、导管、腺泡上皮等接近于正常表现。

3.3 免疫印迹(western blot)分析

图2表 2显示，以 GAPDH作为内参照，用Image J软件处理，分析各实验组条带与对照组条带面积、灰度比值，分别出现分子量为35KD、37KD的条带。各组AQP5表达量比较结果示，与正常对照组比较，模型组 AQP5表达量下降27.90%(Ρ＜0.01);与模型组比较，增液布津汤高、中、低剂量组AQP5表达量分别升高 32.84%(Ρ＜0.01)、12.54%(Ρ＜0.05)、4.51%，同时环戊硫酮组 AQP5表达量升高20.40%(Ρ＜0.01)，说明增液布津汤可以增加颌下腺AQP5的表达量，促进唾液分泌，改善SS模型小鼠口干症状。

4 讨论

图1 增液布津汤对SS模型小鼠颌下腺组织结构变化的影响(HE×200)

图2 各组AQP-5表达的western blot检测结果

现代研究认为，干燥综合征的病理机制主要是由于自身免疫的异常反应，通过各种细胞因子和炎症介质造成外分泌腺体大量淋巴细胞、浆细胞和单核细胞浸润，使腺体细胞破坏、功能丧失［4］。SS患者在静息和刺激状态下唾液流率均降低，可以导致言语困难、进食障碍、口腔念珠菌病、猖龋齿和慢性涎腺炎等一系列病变。在哺乳动物内，迄今至少已发现10种水通道蛋白亚型(从 AQP0到 AQP9)，其中已证实AQP1和AQP5与人唾液分泌密切相关，分别在不同唾液腺组织结构中起重要作用［5，6］。SS病变在各器官的共同病理是淋巴细胞的浸润，无论是浅表外分泌腺还是内脏外分泌腺，其损伤部位均是针对上皮，如唾液腺上皮、肾小管上皮、支气管上皮等，而上皮细胞是水通道蛋白分布的主要部位，表明水通道蛋白与SS的发病确实存在某种联系。

表2 各组AQP5表达的相对灰度值比较(珋x±s，n=3)

该病在中医古典医籍中并无此病名，根据其临床“燥象丛生”的特点，多数医家将其归于“燥痹”范畴，其病机特点为本虚标实。本虚即为诸脏腑气血阴阳亏虚，其中主要为阴液亏损、津枯液涸、脏腑不荣、津液输布失常，而标实主要是瘀毒互结。所以我们认为，阴虚、燥毒、瘀血是 SS发病的主要原因，三者之间相互为患，导致津液运行受阻，输布不畅，口眼失其滋润，内及五脏六腑亦失其所养，以此为据，拟用益气养阴、清燥解毒、活血化瘀、布津通络的增液布津汤治疗本病。药物由麦冬、黄芪、太子参、枸杞子、生地、赤白芍、桃仁、紫菀8味药物组成。研究表明，水通道蛋白在肺、肾、消化系统等器官广泛存在［7］，而中医理论认为体内津液代谢主要与肺、脾、肾三脏相关，表明津液的代谢过程与水通道蛋白之间确实有着某种联系。本实验唾液流量结果显示，与空白组比较，模型组小鼠唾液流量明显下降，用增液布津汤治疗后可以促进SS小鼠唾液分泌，改善口干症状，作用与环戊硫酮效果相当。免疫印迹结果显示，模型组的AQP-5表达水平与正常对照组比较下降了27.90;给药处理的高、中、低剂量组 AQP-5表达水平与模型组比较分别升高了32.84%、12.54%、4.51%，说明增液布津汤高剂量能够显著促进AQP-5的表达。

综上所述，当 SS颌下腺重度破坏时，AQP5的表达量显著减少，导致水分转运失代偿，引起唾液分泌减少，出现口干症状。本实验结果初步表明，增液布津汤可能通过抑制SS模型小鼠颌下腺萎缩、淋巴细胞浸润的病理进程，促进AQP5的表达，从而改善唾液腺分泌功能，增加唾液流量，缓解 SS口腔干燥症状。

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