种猪精子密度快速简易评定技术的建立与验证

文│甄志刚（辽宁省锦州市畜牧技术推广站）

李新国（中牧实业股份有限公司）

王宏军 周铁忠（辽宁医学院）

随着我国生猪产业的迅速发展，人工授精技术已被广泛应用，该项技术的成功应用是加快猪品种改良和提高经济效益的关键。猪精子密度的评定是人工授精技术的关键环节，直接决定着人工授精后母猪的受胎率和产仔数。目前由于商业精子密度仪的价格昂贵和血球计数法测定过程的费时费力，生产中很多技术人员对猪精子密度的评定不得不采用估测法，这种做法极大影响了母猪的受胎率和产仔数以及优秀种公猪的利用效率。因此，研究开发精子密度的快速简易评定技术是养猪生产中亟待解决的问题。不同品种猪的精液特性有差异，目前我国养猪生产中，大多数是利用杜洛克、长白和大白这三种外种猪，因此，建立用于杜洛克、长白和大白种公猪精子密度的快速简易评定技术具有重要意义。本试验以杜洛克、长白和大白种公猪的精液为研究对象，利用精子密度与精液的吸光度之间的数学函数关系，建立了利用721分光光度计评定精子密度的技术，并对其准确性进行了验证。

一、材料与方法

1.试验材料。在辽宁省锦州市余积秋平人工授精站、广地种猪场和黑山县杨翔种猪场，选择杜洛克、长白、大白三个品种，实验人员用徒手采精法收集公猪精液。精液经4层滤纸过滤，确保精液不含尿液等杂质，收集得到的精液在30分钟内开始试验。试验主要使用的仪器和试剂有显微镜、721分光光度计、采精杯、电子天平、过滤纸、载玻片、盖玻片、血细胞计数板、温度计、生理盐水等。

2.试验方法。

（1）猪精子密度快速简易评定技术的建立。选择上述三个品种的种猪，每个品种采集30头猪的精液。根据本实验室前期研究结果，以生理盐水为稀释液， 将新鲜精液稀释10倍，利用721分光光度计在550纳米波长下测定吸光度（A），以生理盐水做空白，用标准血球计数法测定稀释前精子密度，每份精液样品均重复测定3次，取平均值（误差要求在5%以下）。

◎图1 稀释10倍后吸光度与精子密度的幂函数关系

◎图2 稀释10倍后吸光度与精子密度的线性函数关系

表1 721分光光度计法测定猪精子密度的对照表 亿/毫升

（2）猪精子密度快速简易评定技术的验证。选择上述三个品种的种猪，每个品种采集30头猪的精液。以生理盐水为稀释液，分别利用建立的721分光光度计法和血球计数法测定猪精子的密度，每份精液样品均重复测定3次，取平均值。

3. 数据分析。试验数据采用EXCEL及统计软件SPSS16.0进行分析处理，并对吸光度和血球计数法法测定的精子密度进行回归方程拟合，对分光光度计计法和血球计数法测定的精子密度进行相关分析和显著性检验。

二、结果与分析

1.猪精子密度快速简易评定技术的建立。研究结果表明，精子密度与精液吸光度显著相关，两者有多种函数关系，其中乘幂函数是吸光度与精子密度相关最紧密的，相关系数达0.95（R2＝0.9），显著高于线性函数，具体结果见图1和图2。根据获得的回归方程（y＝3.3917x1.2499），制订了利用721分光光度计测定猪精子密度的对照表（见表1），并结合试验操作便利以及试验结果影响因素等方面，制定721分光光度计测定猪精子密度操作指南。

2.猪精子密度快速简易评定技术的验证。试验结果表明，利用721分光度计和精子密度仪测定结果均与血球计数法测定结果显著相关，且相关系数均达0.9以上，这提示利用721分光度计法测定猪精子密度具有可行性，能够真实的反应猪精子密度，可以在生产中推广应用。

三、讨论

猪精子密度评定是人工授精的关键环节之一，采精后必须评定精子密度和活力，然后根据活力、密度和输精有效精子数计算出稀释倍数，这是保证受胎率和产仔数的关键。然而，目前在猪生产上，由于专用精子密度仪价格过高，很多养殖户无法拥有密度仪，只能采用估测法评定精子密度，该法主观性强、准确度差，导致人工授精效果不理想。本试验建立了用于杜洛克、长白和大白种公猪精子密度的简易快速评定方法，经过验证试验证明，该法与血球计数法获得的结果显著相关，可以应用于生产。

为保证分光光度计法评定精子密度的准确性，针对分光光度计的型号、选择合适的波长和稀释倍数至关重要。我们前期研究发现，杜洛克、长白和大白种公猪精液稀释6、8、10倍后，吸光度均在721分光光度计的检测范围内，为实践中操作方便，我们选择了10倍稀释。关于测定精子密度合适的波长，已有研究表明445～580纳米范围内均可测定，我们选用550纳米的测定结果表明重复性好、测定准确。不同种类动物精液吸光度与精子密度的函数关系不一样，有的是直线回归关系，有的是乘幂函数关系。以往报道中，有人利用直线回归函数建立了分光光度计法评定猪精子密度，也有人利用幂函数建立分光光度计法，而比较本试验的研究结果表明猪精子密度与精液吸光度之间最佳关系是乘幂函数关系。

本研究建立的猪精子密度评定技术是根据光的通透性与精子密度的密切相关这一特性开发的，因此，测定结果的准确性受精液成分影响较大，测定时要注意精子密度以外的其他干扰因素。稀释好的稀释液应立即测定，否则因为重力作用精子沉底会造成结果不准确。比色皿应清洗干净，透光面无杂质和划痕，操作时不能用手接触透光面，以免影响吸光度测定结果的准确性。