柚皮黄酮抑制硝化和氧化作用的研究

罗云敬，朱西平，安学静，王 珺

（北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京100124）

黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和调节免疫等功能[1，2］，因此，研究天然产物中黄酮类化合物的生物与化学特性十分重要。芸香科植物柚子产量高，其果皮中除含有芳香油、果胶和色素外，还含有丰富的黄酮类物质[3－5］。柚皮中黄酮类化合物可分为芦丁（芸香苷）、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷[3，6］4种，其中，新橙皮苷与橙皮苷的二苯基色原酮部分结构相同。

目前的研究主要集中在柚皮黄酮类化合物的提取工艺和其中单一成分的性质方面，针对柚皮黄酮清除自由基的作用研究还较少，对其中的关键作用成分还不明确。

鉴于此，作者采用紫外可见分光光度计测定酪氨酸硝化产物3－硝基酪氨酸（3－NT）的有效含量，评价芦丁、柚皮苷、橙皮苷3种柚皮黄酮在抑制过氧亚硝酸根硝化损伤酪氨酸（Tyr）方面的作用，并测定3种柚皮黄酮对Fenton反应产生的羟基自由基（·OH）和邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子自由基）的清除效果。

1 实验

1.1 3－硝基酪氨酸标准曲线的绘制

准确配制1mg·mL－1的3－硝基酪氨酸溶液，用0.05mmol·L－1磷酸盐缓冲溶液稀释成不同浓度的标准溶液，用紫外可见分光光度计测定其吸光度并绘制标准曲线。

1.2 过氧亚硝酸根溶液的制备

取100mL碱性 H2O2溶液（pH 值为12.5～13.0）与等摩尔量的亚硝酸异戊酯，在0～4℃（冰水混合物）反应9h左右；用MnO2清除剩余H2O2溶液，所得溶液和1mol·L－1NaOH溶液于－20℃混合，即得27mmol·L－1过氧亚硝酸根溶液，保存备用。

1.3 柚皮黄酮类化合物对过氧亚硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用测试

将过氧亚硝酸根溶液分步稀释、加入到含4mmol·L－1的酪氨酸、不同浓度柚皮黄酮（芦丁、柚皮苷、橙皮苷）的磷酸盐缓冲溶液（pH＝7）中，最终体积为3 mL，37℃恒温水浴60min，用紫外可见分光光度计测定3－硝基酪氨酸在365nm处的吸光度[7］。

1.4 清除羟基自由基实验

取0.5mL 9mmol·L－1FeSO4、0.5mL 9mmol·L－1水杨酸－乙醇、1mL不同浓度的柚皮黄酮，混合均匀后，加入1mL 9.8mmol·L－1H2O2启动反应，最终体积为3mL，37℃水浴加热60min，在510 nm下测定吸光度，以抗坏血酸（Vc）作阳性对照。按式（1）计算羟基自由基清除率[8］：

式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入柚皮黄酮溶液后的吸光度；Ax0为不加显色剂 H2O2时的吸光度。

1.5 邻苯三酚自氧化率测定

将2.8mL Tris－HCl缓冲溶液、0.1mL超纯水混匀置于试管中，另取0.1mL酸性邻苯三酚置于另－试管中放置；25℃预热后，立即将两试管溶液在比色皿中混匀并用紫外可见分光光度计检测邻苯三酚自氧化产物的吸光度随时间的变化。检测时间为3min。平行测定3次，取平均值。

1.6 清除超氧阴离子自由基实验

样品体系（最终浓度）：50mmol·L－1缓冲溶液（pH 值7.8）、80mmol·L－1酸性邻苯三酚、不同浓度的柚皮黄酮溶液。以超纯水代替柚皮黄酮作为对照体系。以抗坏血酸（VC）作阳性对照。按式（2）计算超氧阴离子自由基清除率[9］：

式中：△A0为邻苯三酚自氧化的速率；△A1为清除超氧阴离子自由基后邻苯三酚自氧化的速率。

2 结果与讨论

2.1 清除羟基自由基的效果（表1 ）

由表1 可看出，当柚皮苷的浓度为0.4μg·mL－1时，清除率为46.8%；当柚皮苷浓度达到1.0μg·mL－1时，清除率高达81.6%，几乎是0.4μg·mL－1时的2倍。橙皮苷在2.0μg·mL－1时的清除率几乎是0.6μg·mL－1时的4倍。芦丁在10μg·mL－1时的清除率为88.4%，是2μg·mL－1时的16倍。芦丁的作用浓度要高于柚皮苷和橙皮苷，芦丁在浓度2μg·mL－1时的清除率只有5.5%，而该浓度下橙皮苷的清除率达到68.5%，柚皮苷更是在1.0μg·mL－1时清除率就高达81.6%。

文献报道的清除羟基自由基的天然产物的浓度基本是在 mg·mL－1水平[10，11］，而本实验柚皮黄酮在μg·mL－1水平就已经表现出非常好的清除作用。

由表1 还可看出，3种黄酮类化合物在μg·mL－1水平清除羟基自由基的效果非常理想，且清除率均表现出良好的浓度依赖关系，清除50%羟基自由基所需要的化合物浓度（IC50）分别为：芦丁8.0μg·mL－1、柚皮苷0.8μg·mL－1、橙皮苷1.0μg·mL－1，清除作用大小依次为：柚皮苷＞橙皮苷＞芦丁，柚皮苷清除羟基自由基的作用最强，是芦丁的10倍、橙皮苷的1.25倍。

表1 芦丁、柚皮苷、橙皮苷清除羟基自由基的效果Tal.1 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing·OH

2.2 对过氧亚硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用（表2 ）

表2 芦丁、柚皮苷、橙皮苷对过氧亚硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用Tab.2 Effects of rutin，naringin，hesperidin on inhibiting the nitration of tyrosine by peroxynitrite

由表2 可看出，当芦丁、橙皮苷浓度为10μg·mL－1时，3－硝基酪氨酸的浓度分别为0.412mg·mL－1、0.407mg·mL－1，与对照相近；当柚皮苷的浓度从2μg·mL－1增加到10μg·mL－1时，3－硝基酪氨酸的浓度从0.409mg·mL－1降至0.380mg·mL－1。表明，柚皮苷对过氧亚硝酸根硝化具有抑制作用，且该抑制作用具有浓度依赖性，而芦丁和橙皮苷没有明显的抑制硝化的作用。

2.3 清除超氧阴离子自由基的效果（表3 ）

表3 芦丁、柚皮苷、橙皮苷清除超氧阴离子自由基的效果Tab.3 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing

表3 芦丁、柚皮苷、橙皮苷清除超氧阴离子自由基的效果Tab.3 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing

样品 浓度／μg·mL－1 清除率／%芦丁16 17.24柚皮苷 16 13.79橙皮苷16 10.35

由表3 可看出，当芦丁、柚皮苷、橙皮苷浓度为16 μg·mL－1时，对超氧阴离子自由基的清除率分别为17.24%、13.79%和10.35%。表明，柚皮黄酮在μg·mL－1水平显示出清除超氧阴离子自由基的作用，作用大小依次为：芦丁＞柚皮苷＞橙皮苷。

2.4 讨论

本实验提供了一个较为全面的评价或筛选天然产物抑制或清除ONOO－、和·OH等自由基的方法。ONOO－能再分解生成和·OH，从而导致硝化损伤，而·OH会导致氧化损伤。利用Fenton反应产生·OH[10］，3种柚皮黄酮对·OH 均在μg·mL－1水平表现出浓度依赖的清除作用。可以由和NO·结合而生成，清除对于抑制ONOO－的硝化作用也具有非常重要的意义。

3 结论

以抑制过氧亚硝酸根硝化酪氨酸生成3－硝基酪氨酸评价了柚皮黄酮的抗硝化作用；以Fenton反应产生羟基自由基体系和邻苯三酚自氧化产生超氧阴离子自由基体系，用紫外可见分光光度法测定了柚皮黄酮对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除效果。结果表明，柚皮苷的抗硝化作用较强，而芦丁和橙皮苷没有明显的抗硝化作用；3种柚皮黄酮清除羟基自由基的效果在μg·mL－1水平就已经比较显著（超过50%），且显示出浓度依赖性，作用大小依次为：柚皮苷＞橙皮苷＞芦丁；3种柚皮黄酮在μg·mL－1水平清除超氧阴离子自由基的作用大小依次为：芦丁＞柚皮苷＞橙皮苷。

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