脑室周围白质软化大鼠脑组织NF－κBp65蛋白表达与细胞凋亡的关系

杨 蕾 唐成和

1）河南新乡市中心医院 新乡 453000 2）新乡医学院第一附属医院 卫辉 453100

早产儿脑室周围白质软化逐步增多，通过检测NF－κBp65蛋白在脑室周围白质软化大鼠中的表达变化，并与凋亡状况进行对比分析，探讨其在脑室周围白质软化中的作用，为早产儿脑室周围白质软化防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1实验对象研究对象选取100只健康新生SD大鼠，3日龄，无性别选择，体质量6～10g，完全随机方法分为实验组、对照组各50只；再进一步将2组大鼠随机分为6h、12h、24h、72h、7d组，每组10只，分别于大鼠足部贴上标签。各组大鼠日龄、体质量指标经比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2方法与观察指标将实验组大鼠的单侧颈总动脉结扎，并置于6%O2＋94%N2的氮氧混合器环境中4h，建立实验动物模型。对照组仅分离单侧颈总动脉，但不予结扎和缺氧处理。分别于术后6h、12h、24h、3d和7d对2组大鼠行心脏灌注，断头取脑制作成石蜡标本［1－2］，显微镜下观察标本变化情况，TUNEL法检测脑组织细胞凋亡状况和免疫组化SABC法检测NF－κBp65基因的蛋白表达变化；记录2组大鼠的一般情况、体质量、行为学变化等。

1.3统计学分析采用SPSS 17.0进行统计学处理，全部结果用均数±标准差表示。实验组和对照组差异有无统计学意义采用两独立样本t检验。不同时间点各组差异有无统计学意义采用方差分析，并进行两两比较。

2 结果

2.1术后大鼠一般情况100只实验大鼠中，对照组50只全部存活，实验组50只死亡4只，存活率92%，明显低于对照组（P＜0.05）。实验组大鼠在一侧颈动脉结扎后即出现不同程度的异常反应，如皮肤苍白或发绀、烦躁不安甚至抽搐，体质量增长缓慢等异常表现。实验组大鼠体质量术后6h与同时间点对照组差异无统计学意义（P＜0.05）。实验组大鼠12h有体质量下降，明显低于对照组，术后12h、24h、72 h、7d与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 2组大鼠术后一般情况比较

2.2脑组织病理形态学改变大体观察：实验组大鼠病灶侧大脑半球术后6～12h轻度水肿，以24h脑水肿最为明显，病灶侧则更显著。大体观察缺氧处理后72h水肿减轻，7 d可见脑萎缩及软化。对照组大鼠未见明显异常。病理观察结果：光镜下可见对照组侧脑室旁白质和胼胝体细胞排列有序，纤维组织明显，胞核圆形淡染，两侧侧脑室对称，染色清晰。实验组随缺血缺氧时间延长病理改变呈动态变化。缺氧缺血12h侧脑室旁白质内胶质细胞胞体肿胀；24h镜下可见星形胶质细胞肥大、小胶质细胞增生；72h可见侧脑室旁白质广泛疏松；7d右侧大脑侧脑室旁白质呈筛网状坏死。

2.3细胞凋亡阳性率在脑损伤过程中的表达变化实验组细胞凋亡阳性表达率随时间变化动态变化，6h开始表达，此后逐步上升，72h达到峰值，7d细胞凋亡阳性率下降。对照组细胞凋亡阳性率各时间点无明显变化。实验组与对照组在6h、12h、24h、72h、7d五个观察时间点比较均有统计学意义（P＜0.05）。实验组组间比较结果具体见表2。在阴性对照图片中，未见阳性细胞。

2.4 NF－κBp65蛋白质的表达变化实验组和对照组大鼠脑组织均可见NF－κBp65蛋白质的表达，对照组表达量少，且无明显变化。实验组缺氧后6h脑室周围白质NF－κBp65表达开始增加，12h、24h、72h组虽呈上升趋势，但两两比较差异无统计学意义（P＞0.05），7d达最高值。实验组同对照组各个时间点的结果经统计学处理均存在显著差异。

表2 各时间点实验组与对照组胼胝体区调亡细胞阳性率比较 （s）

表2 各时间点实验组与对照组胼胝体区调亡细胞阳性率比较 （s）

注：表示与6h组比较，P＜0.05；▲表示与12h组比较，P＜0.05；★表示与24h组比较，P＜0.05；◆表示与3d组比较，P＜0.05；●表示与7d组比较，P＜0.05；对照组各时间点两两比较，P均＞0.05

F P实验组 46 0.2216±0.0419★◆●0.2596±0.0133◆● 0.2925±0.0422◆ 0.3102±0.0422▲★●0.2887±0.0595▲◆ 10.806 ＜组别 n 6h 12h 24h 3d 7d 0.05对照组 50 0.0520±0.0007 0.0603±0.0006 0.0582±0.0005 0.0554±0.0010 0.0622±0.0008 1.326 ＞0.05 t 0.05 10.46 12.20 8.30 11.33 10.75 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜值

表3 不同时间点胼胝体区实验组与对照组NF－κBp65蛋白平均光密度表达结果 （s）

表3 不同时间点胼胝体区实验组与对照组NF－κBp65蛋白平均光密度表达结果 （s）

注：表示与6h组比较，P＜0.05；▲表示与12h组比较，P＜0.05；★表示与24h组比较，P＜0.05；◆表示与3d组比较，P＜0.05；●表示与7d组比较，P＜0.05；对照组各时间点两两比较，P均＞0.05

实验组 46 4.220±0.990▲★◆● 6.865±0.690● 6.936±0.714● 7.235±1.010● 12.167±2.704▲★◆ 24.275 ＜0.05对照组 50 1.606±0.087 1.594±0.094 1.602±0.013 1.598±0.113 1.600±0.098 1.098 ＞0.05 t 0.05 6.468 18.712 18.3 13.671 9.573 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜值

2.5 NF－κBp65的表达水平与其细胞凋亡相关性分析脑室周围白质NF－κBp65的表达水平在脑损伤早期呈缓慢增高趋势，7d时仍高表达，而细胞凋亡在72h表达阳性率最高，之后呈下降趋势。二者相关性分析提示相关系数（r）为0.432（P＜0.05），呈正相关。

3 讨论

脑室周围白质软化可致严重神经系统后遗症如脑性瘫痪、听视觉障碍等，缺氧缺血是其病因之一。神经细胞的凋亡可加重缺氧缺血后神经损伤，是引起迟发性脑损伤的主要原因，临床加重患儿神经系统后遗症［3］。实验显示缺氧缺血后6h可见凋亡细胞，12h、24h明显增多，72h凋亡指数达到最高，7d下降，与对照组比较各个时间点均有显著差异，这与文献报道缺氧缺血后48h达到高峰，72h明显下降的变化趋势基本一致，并且与本实验苏木精－伊红染色所示病理改变的严重程度相对应，提示细胞凋亡是新生大鼠脑白质损伤的重要机制之一。

NF－κBp65在其与细胞内的相关信息传递并引发相应的基因表达，从而产生一系列生理反应。李鑫等的文献指出，NF－κBp65存在于各类神经系统的细胞中，在脑组织发生缺血缺氧进而产生脑白质病变的发生过程中，NF－κBp65通过多种途径和环节参与其中。研究结果表明，在被研究的5个时间点范围内，实验组大鼠NF－κBp65于术后6h起含量开始逐步提升，7d时最高。提示实验组大鼠在经过单侧颈总动脉结扎后，脑部逐渐出现的缺血缺氧状态刺激了NF－κBp65与IκB的脱离，提高脑白质细胞的凋亡率。NF－κBp65对于氧化反应具有较高的敏感性，也就是说，当脑组织氧化反应加强时，会进一步诱导NF－κBp65的大量激活，并引导其参与到脑缺血后脑组织、脑神经的损伤过程中。脑缺血后，脑内由于缺血缺氧使氧化反应受到抑制，并进一步影响NF－κBp65的表达与被激活，从而减少了诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达，细胞内活性氮和活性氧的产生减少，并有利于减少氧化应激损伤［4］。

近年来，相关文献证实，NF－κBp65为细胞凋亡的调控因子之一［5］。Chen等的相关研究提出，NF－κB对抗凋亡基因具有明显的抑制作用，从而促进细胞凋亡。当然，在这以前，已经有很多研究者通过实验验证，NF－κB具有细胞凋亡抑制的作用。其可诱导抗凋亡基因Bcl－2和Bcl－XL等多种细胞凋亡抑制蛋白的表达。这两种结论之间似乎存在着矛盾，但通过医学界不断的深入研究，最终发现NF－κB对于细胞凋亡的促进或抑制与NF－κB亚单位的数量及种类有关。若亚基因RelA过表达时，NF－κB对细胞凋亡产生抑制作用，而当c－RelA过表达时，NF－κB对细胞凋亡则起到促进作用［6］。故本研究通过观察NF－κBp65蛋白表达于细胞凋亡关系，为此方向研究提供依据。

在本实验大鼠脑缺血缺氧的模型中，NF－κBp65呈现上升趋势，并于7d达到高峰。实验组大鼠在缺血缺氧的前提条件下，脑白质细胞发生凋亡，术后6h细胞开始出现明显凋亡，而3d时达到凋亡高峰。经相关性分析发现，NF－κBp65与细胞凋亡呈正相关。但72h内呈显著正相关，而72h后NF－κBp65仍持续高水平表达，与细胞凋亡有负相关趋势，是否随病情转变体内的传导通路发生改变亦或NF－κBp65对凋亡的调控呈双向作用需做进一步研究证实。

［1］李德渊，陈娟，石晶，等 .新生大鼠脑室周围白质软化模型的建立及评价［J］.中华妇幼临床医学杂志，2007，3（6）：320－325.

［2］袁宝莉，李瑞林，周戬平，等 .新生大鼠脑白质损害模型的建立与评价［J］.新生儿科杂志，2004，19（1）：17－19.

［3］陈惠金 .早产儿脑室周围白质软化的研究进展［J］.实用儿科临床杂志，2004，19（3）：83－86.

［4］胡文忠，王晓强 .一氧化氮与一氧化氮合酶抑制剂对脑缺血后海马神经元的保护作用［J］.中国实用神经疾病杂志，2011，14（3）：10－12.

［5］张俊清，王伟，薛钢，等 .急性缺血再灌注大鼠脑中γ－氨基丁酸A型受体α1mRNA的表达变化［J］.中国实用神经疾病杂志，2010，13（1）：1－3.

［6］濮宏建，方黎明，朱岁军，等.NF－κB在大鼠颅脑损伤后表达水平与细胞凋亡的关系［J］.中华创伤杂志，2009，25（10）：880－883.