外周血淋巴细胞替代肺癌细胞体外药敏实验的相关性研究

段国辰 杜锦波 牛占丛

化疗在非小细胞肺癌治疗中占有重要地位。常用的化疗方案来源于多地区，大样本的临床统计资料。但部分具有相同病理类型患者对同一化疗方案却显示不一样的疗效。如何选择化疗药物，实现肺癌患者的个体化治疗，提高疗效，已经成为国内外学者的研究热点。有文献报道:多种器官恶性肿瘤的原代细胞培养及其药敏实验可以作为个体化化疗的理论指导［1，2］。研究证实，不同个体之间对药物的敏感性与其遗传因素有着很大的关系。外周静脉血淋巴细胞与实体瘤细胞同样具有耐药基因的表达［3］。有文献报道MTT法检测自身外周血淋巴细胞和患者癌细胞对同一化疗药物的敏感性存在良好的正相关性［4］。然而其相关性在肺癌方面的研究甚少。本实验采用MTT法测定60例自身外周血淋巴细胞及其肺癌细胞对常用的4种化疗药物的敏感性，探讨两者的相关性旨在用外周血淋巴细胞替代肺癌细胞进行化疗药敏检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年03月至2011年09月我院收治的60例肺癌手术标本，且术前均未接受放疗及化疗治疗。其中鳞癌34例，腺癌26例。根据UICC(1997)的分期标准:Ⅰb期10例，Ⅱ期30例，Ⅲa期20例。切除的肿瘤组织，均有病理学诊断。

1.2 方法 在手术室无菌条件下，取约黄豆大小的肿瘤组织，经大量0.9%氯化钠溶液充分冲洗后置于含有双抗的RPMI-1640培养液的标本瓶中，立即送检。所有患者于术中切除肺癌组织后抽取外周静脉血2 ml置于EDTA管中。

1.2.1 肺癌细胞单细胞悬液制作方法:①取小块约黄豆大小的新鲜肿瘤组织用500 ml 0.9%氯化钠溶液充分洗净去除表面的血细胞后立即浸入含有双抗的RPMI-1640培养液的无菌小瓶中，立即送往实验室。②将取下的肿瘤组织放入培养皿中，用RPMI-1640液冲洗后再用眼科剪去除组织表面的脏层胸膜，及非肿瘤组织。再将肿瘤组织用眼科剪剪成肉末状。③加入0.5 ml胰酶消化液放入37℃恒温箱中培养15 min。④取出消化好的肿瘤组织，加入10 ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640液终止消化。⑤将此肿瘤细胞液经200目的钢网过滤，再反复吹打，即可得到单细胞肿瘤液。⑥使用台盼蓝染色法计数，最终调整细胞数为(1～2)×105/ml。

1.2.2 淋巴细胞单细胞悬液制作方法:①在无菌条件下，将外周静脉血2 ml加入10 ml的离心管中，再缓慢加入2 ml的人淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心30 min。②分离出位于中层的白色细胞层即为外周血淋巴细胞层，用pbs液洗涤2次，弃去上清液。③用含10%胎牛血清的RPMI-1640液配制成单个细胞悬液。④使用台盼蓝染色法计数，最终调整细胞数为(1～2)×105/ml。

1.3 分组加药 (1)加药组:肺癌细胞或淋巴细胞单细胞悬液100μl/孔，化疗药10μl/孔，含10%胎牛血清的RPMI-1640液90μl/孔。(2)阴性对照组:肺癌细胞或淋巴细胞单细胞悬液100μl/孔，含10%胎牛血清的 RPMI-1640液100μl/孔。(3)空白对照组:含10%胎牛血清的RPMI-1640液200μl/孔。每组10个复孔，加药后经震荡充分混匀，将96孔板置于37℃、5%CO2恒温箱中培养48 h。(4)培养44 h后将 MTT试剂20μl/孔分别加入96孔板中，继续培养4 h。从37℃、5%CO2恒温箱中取出96孔板，每孔吸去上清液200μl，再将每孔加入DMSO 100μl，再将96孔板放置于震荡器震荡15 min使沉淀充分溶解，用酶标仪(波长为490 nm)测每孔的OD值，据相对抑制率来判断药物敏感性。(5)计算公式如下相对抑制率=(1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%。

1.4 判定标准 高度敏感为相对抑制率≥50%;敏感为相对抑制率≥30%;耐药为相对抑制率＜30%［5］。

1.5 统计学分析应用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，两两比较采用χ2检验，相关性分析采用直线相关，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 同一种化疗药物卡铂、长春新碱、五氟尿嘧啶、环磷酰胺对患者肺癌细胞和自身外周血淋巴细胞的抑制率之间具有良好的正相关性。相关系数分别为:0.701、0.668、0.543、0.696，且有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 60例肺癌患者肿瘤细胞及自身外周血淋巴细胞对4种化疗药物敏感性的相关性比较n=60，±s

表1 60例肺癌患者肿瘤细胞及自身外周血淋巴细胞对4种化疗药物敏感性的相关性比较n=60，±s

药物 肿瘤细胞 淋巴细胞 相关系数 P值CBDCA 34.51±7.20 26.48±5.51 0.701 0.000 VCR 29.04±5.41 21.04±4.75 0.668 0.000 5-Fu 31.40±4.84 22.73±3.47 0.543 0.000 CTX 26.05±3.32 16.85±3.27 0.696 0.000

2.2 根据60例肺癌细胞和自身外周血淋巴细胞对化疗药物的敏感率(敏感率=敏感病例数/病历总数×100%)来分析:患者肺癌细胞和自身外周血淋巴细胞对相同化疗药物卡铂、长春新碱、五氟尿嘧啶、环磷酰胺的敏感率无显著性差异，χ2值分别为 0.786、1.645、0.263、0.261，且均无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

表2 60例肺癌患者肿瘤细胞及自身淋巴细胞对4种化疗药物的敏感率比较 n=60，例

3 讨论

到21世纪初，在癌症死亡原因中，患肺癌的死亡率已由20世纪70年代的第4位跃居到第一位。肺癌的治疗包括手术治疗、放射治疗、化学治疗和生物治疗。其中化疗可杀死血液里的肿瘤细胞作为全身治疗已成为肿瘤治疗的不可替代的方法。目前在临床使用的抗癌药物均有不同程度的毒副作用，这是由于抗癌药物对肿瘤细胞的选择性不佳，导致化疗失败。所以针对个体化的化学治疗逐渐成为研究的重点。MTT法被广泛用于肿瘤细胞的抗癌药物敏感实验，为个体化化学治疗提供了实验基础［6，7］，很大程度上避免耐药性的发生，因此也减少了用药的盲目性，同时在很大程度上减少了肿瘤的复发和远处转移，提高了五年生存率［8］。

临床经常遇到以下问题:大多数肺癌患者一经发现就属晚期，失去手术机会;或由于各种原因无法得到足够量的肺癌组织标本;多次化疗的肺癌患者效果差疑似药物敏感谱发生改变;如何进行个体化化疗。针对上述因标本来源问题无法进行肺癌细胞体外药敏实验的患者来说，能否利用外周血淋巴细胞培养进行化疗药物敏感实验来代替肿瘤细胞对化疗药物的敏感性已成为目前研究的热点。白细胞数为患者能接受化学治疗的重要参考指标。在临床工作中肺癌患者接受化疗的同时，自身白细胞也会有一定程度的降低，这一现象说明化疗药物不仅能杀伤肿瘤细胞，同时也能杀死外周血淋巴细胞。我们通过基因组计划的顺利完成得知同一个体的正常体细胞与肿瘤细胞在基因组上是完全相同的。目前已经有大量研究表明，肿瘤细胞与外周血淋巴细胞携带有大量的同源基因，均具有耐药基因表达［9］。本实验显示:肺癌患者肿瘤细胞及其自身外周血淋巴细胞对同一种化疗药物卡铂、长春新碱、五氟尿嘧啶、环磷酰胺的敏感性是基本一致的。由表2可知肺癌细胞及自身外周血淋巴细胞对同一化疗药物卡铂、长春新碱、五氟尿嘧啶、环磷酰胺的敏感性具有良好的正相关性。相关系数分别为:0.701、0.668、0.543、0.696，且均具有统计学意义。本结果表明肺癌细胞和自身外周血淋巴细胞对相同化疗药物卡铂、长春新碱、五氟尿嘧啶、环磷酰胺的敏感率无显著性差异，χ2值分别为0.786、1.645、0.263、0.261，且均无统计学意义(P ＞ 0.05)。由此结果提示:肺癌患者外周血淋巴细胞替代肿瘤细胞进行体外药敏实验是可行的。所以当患者已经失去手术机会，无法获得肺癌组织标本及病理类型或者随着化疗次数的增加，肿瘤细胞的药物敏感性可能会有所改变，因无法取得肿瘤组织标本进行药敏检测，此时应用外周血淋巴细胞来替代肺癌细胞进行药敏实验则更具有临床意义。

肺癌原代细胞培养的药敏试验为肺癌患者筛选合适的化疗药物具有重要的意义，同时很大程度上避免了用药的盲目性。为肺癌的个体化化学治疗提供了思路。同时可以减轻不必要的药物浪费，提高疗效。淋巴细胞代替肺癌细胞进行药敏试验来选择化疗药物是可行的。这样便可以解决以下问题:(1)患者已经失去手术机会，无法获得肺癌组织标本及病理类型。(2)肿瘤细胞难以纯化、非肿瘤成分多容易干扰药敏结果。(3)肿瘤组织污染较重，明显影响药敏结果。(4)多次化疗的肺癌患者效果差疑似耐药。

本研究以MTT法为手段检测了60例自身外周血淋巴细胞及肺癌细胞体外的药物敏感性。结果显示:同一化疗药物对同一例肺癌患者的外周血淋巴细胞和肺癌细胞的抑制率具有良好的正相关性。另外，体内和体外对药物的代谢动力学存在差异，应进行长期的体外药敏实验指导临床患者的化学治疗，进一步验证体外药敏实验指导临床化疗的可行性，为肺癌患者的个体化治疗提供更多的实验依据。

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7 张凤梅，李胜水，许华，等.体外MTT药敏试验在指导原发性肝癌化疗中的作用.医学研究杂志，2009，38:68-69.

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