酵母细胞表达金属硫蛋白对铅离子的吸附研究

李 敏， 梁 波， 于梁梁， 徐 琼

(1.东华理工大学放射性地质与勘探技术国防重点学科实验室，江西南昌 330013;2.东华理工大学化学生物与材料科学学院，江西南昌 330013)

生物吸附法是目前处理工业废水的有效方法之一(吴志良等，2008)。目前已有多种微生物被用于重金属离子的生物吸附，包括藻类、细菌、真菌及酵母等(Wang et al.，2009)。其中，酿酒酵母已被证明对 Cu2+，Cr3+，Pb2+，Hg2+，Cd2+，As3+等多种金属离子具有较强的吸附能力(Wang et al.，2006;Zhang et al.，2009;Peng et al.，2010;杨静静等，2011;Wu，et al.，2012)，而对 Pb2+，Hg2+的亲和力显著高于Cu2+，Cr3+等金属离子(Dhankhar et al.，2011)。对于重金属离子的生物吸附研究，尽管目前已经取得了一定的进展，然而对于如何进一步提高微生物的吸附量，仍是亟需解决的主要问题(Kiyono et al.，2006;Chen et al.，2007;Ghorbani et al.，2011)。

目前对于微生物吸附包括铅在内的重金属的研究机制认为，微生物细胞对重金属离子的生物吸附主要是通过与细胞壁表面的一些基团形成离子或共价键来实现。除此之外，微生物细胞还可以通过离子转移系统，把重金属离子转运到细胞内部，并与细胞内大分子物质的功能基团相结合，从而将金属离子积累在细胞内(Lin et al.，2011)。这种在微生物细胞中表达金属络合物，增强金属离子在细胞内的积累，已成为提高细胞吸附容量的一条有效途径。金属硫蛋白(MTs)就是这类物质最典型的代表，MTs已被证明可以有效地结合 Hg2+，Cd2+，Ag+，Zn2+，Cu2+等金属阳离子(Su et al.，2009;方彩云等，2011)，不同物种及不同亚型的MTs对重金属的吸附能力各不相同，其中人类的金属硫蛋白络合能力最强。本研究将人源的金属硫蛋白基因(mt)转化入酵母细胞中，并研究了工程细胞对水溶液中Pb2+的吸附能力。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)菌株和质粒。酿酒酵母菌株INVSC1(histrp－leu－ura－)、穿梭质粒 pYES2(ura+Ampr)、大肠杆菌(E.coli)DH5α均为本实验室保存。

(2)酶及主要试剂。限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶均购于Fermentas公司;DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于TIANGEN公司;引物合成及测序由上海生工生物工程有限公司完成;Pb(NO3)2及其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 金属硫蛋白基因(mt)的获得

根据Genebank数据库中的人肝金属硫蛋白的基因序列，结合酿酒酵母的密码子使用规律，改造并合成可在酿酒酵母中高效表达的金属硫蛋白基因(mt)，并将基因连接在pUC57载体的Bam HI/Xho I酶切位点处。mt基因序列如下:

GGATCCATGGACCCAAACTGCTCCTGCGC

TACTGGTGGTTCCTGCACCTGCACTGGT

TCCTGCAAATGCAAAGAATGCAAATGCAC

CTCCTGCAAGAAGTCTTGCTGCTCCTGCT

GCCCAATGTCTTGTGCTAAGTGTGCT

CAAGGTTGCATCTGCAAAGGTGCAT

CAGAAAAGTGCTCTTGCTGTGCTCTCGAG

1.2.2 酵母表达载体pYES2-mt的构建及转化

以载体 pUC57-mt为模版，设计上游引物UINV:5’-ATCGGGATCCACGATGGACCCAAACTG CTCCTGCG-3’， 下 游 引 物 DINV:5’-CGATCTCGAGTCAAGCACAGCAAGAGCACTTTTCT GATG-3’PCR扩增mt基因。扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收。回收产物经限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切，加入经相同酶切的载体pYES2，16℃过夜，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞中，并全部涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。随机挑取大肠杆菌转化子，菌落PCR鉴定，获得重组载体pYES2-mt。

将酿酒酵母INVSC1菌株接种至YPD液体培养基中，30℃培养过夜。制备酵母感受态细胞，并用醋酸锂介导的转化法，将表达载体pYES2-mt转化到酵母细胞中(Gietz et al.，2007)，用含有2%葡萄糖的基本培养基(SC-U-G)筛选转化子。随机挑取酿酒酵母转化子，菌落PCR鉴定，获得重组酿酒酵母INVSC1-mt菌株。

1.2.3 酵母细胞吸附材料的制备

将重组酵母菌株INVSC1-mt接种至SC-U-G液体培养基中，30℃培养过夜。离心收集细胞，并用无菌水清洗。将清洗过的细胞接种至含有2%半乳糖的基本培养基(SC-U-β)中，使OD600为0.4。30℃诱导培养36 h后，收集并清洗细胞，用于Pb2+的吸附实验。

1.2.4 酵母细胞对Pb2+吸附量的测定

在100 mL的三角瓶中加入30 mL 100 mg·L－1的Pb(NO3)2溶液，加入湿重1 g的酵母细胞，在30℃，150 rpm条件下震荡培养。分别于培养后10，20，30，60，90和120 min取样，样品经离心沉淀细胞，原子吸收法测定上清液中的Pb2+浓度。实验设野生型酵母细胞INVSC1为对照。Pb2+的吸附量与吸附率按下式计算:

式中:Q为吸附量(mg/g);V为溶液体积(L);C为Pb2+溶液平衡浓度(mg/L);C0为Pb2+溶液初始浓度(mg/L);M为吸附剂质量(g);R为吸附率(%)。

2 实验结果

2.1 表达载体pYES2-mt的构建

以UINV和DINV为引物，以载体pUC57-mt为模板，PCR扩增mt基因，凝胶电泳结果显示(如图1)，扩增得到一条大小约为200 bp的片段，无非特异性条带产生，该片段与预期片段大小相符。载体pYES2和mt基因分别经双酶切、连接，并转化大肠杆菌DH5α，37℃培养后，每个平板获得大约300～500个抗性菌落。

随机挑取7个大肠杆菌抗性菌落，菌落PCR反应鉴定重组载体pYES2-mt，结果如图2所示，其中泳道6有特异性条带产生，大小约为200 bp，与mt基因大小相符，初步鉴定为阳性菌落。本实验得到的阳性菌落比例较小，考虑可能为载体双酶切产物中含有大量单酶切片段，经连接酶连接后重新环化，转化大肠杆菌后长成抗性菌落。对泳道6对应的大肠杆菌中的目的片段进行DNA测序，测序结果表明，mt基因已连接入载体pYES2中。mt基因序列正确，在PCR扩增的过程中无突变发生，重组载体pYES2-mt可用于表达研究。

2.2 酿酒酵母细胞的转化

用醋酸锂法将表达载体pYES2-mt转化到新鲜制备的酵母感受态细胞中。培养36 h后，在1 μg质粒、100 μg单链载运 DNA 及 700 μL 1 ×LiAc/40%PEG-3350/1×TE存在的条件下，100 μL酿酒酵母INVSC1感受态细胞的转化率为2×105/μg DNA。

图1 以质粒pUC57-mt为模板的扩增产物Fig.1 DNA products amplified with pUC57-mt as template

图2 大肠杆菌E.coli pYES2-mt菌落PCR鉴定Fig.2 Colony PCR results of mt gene in strain E.coli(pYES2-mt)

随机挑取酿酒酵母转化子单菌落，菌落PCR反应鉴定阳性菌株。电泳结果显示(图3)，泳道3有一条大小约200 bp的目的片段，表明相应的酵母菌株为阳性转化子。将转化了mt基因的酿酒酵母菌株记为S.cerevisiae INVSC1-mt。

2.3 酿酒酵母INVSC1-mt菌株对Pb2+的生物吸附

以野生型菌株为对照，初步测定了表达金属硫蛋白的酿酒酵母INVSC1-mt菌株对Pb2+的吸附作用。结果表明(图4)，在浓度为100 mg/L的Pb2+溶液中，两种细胞的吸附量均达到了4 mg/g湿重细胞以上，吸附效果显著。随着吸附时间的增加，无论是野生型菌株，还是表达了MT的工程菌株，Pb2+的吸附量和吸附率均逐渐增大，在10 min时，吸附率分别为78.35%和85.88%，120 min时，吸附率达到了90.44%和96.81%。进一步研究发现，表达了MT的酿酒酵母INVSC1-mt菌株对Pb2+的吸附量明显高于野生型菌株，尤为值得注意的是，酿酒酵母INVSC1-mt菌株吸附Pb2+的速度较快，在30 min时，其吸附率就达到了96.03%，吸附量为5.76 mg/g湿重细胞，而在30～120 min，吸附率没有显著的增加。相比之下，野生型菌株在30 min时，吸附率远低于INVSC1-mt菌株，为86.48%，至120 min，其吸附率才达到90.44%。

3 结论

在多种微生物、动物和植物细胞内普遍存在对金属离子具有亲和能力的蛋白质，称为金属结合蛋白，它们可与环境中的金属离子通过化学结合作用形成复合物而降低，消除金属离子对生物细胞的毒性，进而提高金属离子的胞内积累。目前研究的金属结合蛋白主要为天然存在的结合蛋白，如金属硫蛋白、金属硫蛋白样蛋白、植物螯合素、金属抗性调控蛋白，以及生物体含金属酶和金属转运蛋白结构域的模拟物以及金属结合肽的模体等(Kazumasa et al.，2005;Kao et al.，2008;Kotrba et al.，2010;Mehran，2008)。

图3 酿酒酵母S.cerevisiae INVSC1-mt转化子的PCR鉴定Fig.3 Colony PCR results of strain S.cerevisiae INVSC1-mt

图4 表达MT的重组酿酒酵母INVSC1-mt菌株对Pb2+的吸附作用Fig.4 Biosorption capacity and rate of Pb2+by recombinant strain S.cerevisiae INVSC1-mt

本研究通过改造并合成人源金属硫蛋白基因，并将该基因转入酿酒酵母细胞内进行了高效表达，同时研究了工程菌对Pb2+的吸附作用。研究结果表明，金属硫蛋白基因的表达有助于提高酿酒酵母细胞对Pb2+的吸附作用，其最大吸附量比野生型菌株提高了11%。尤为重要的是，工程菌吸附Pb2+的速度明显加快，在30 min内对Pb2+的吸附率即达到了96.03%，这在实际应用中将大大缩短微生物对废水的处理时间，有利于提高处理效率，具有潜在的应用价值。本研究结果进一步确证了，应用基因工程技术在微生物细胞内大量合成金属结合蛋白，通过细胞的新陈代谢作用，将金属离子转运到细胞内与相关蛋白螯合结晶，是提高微生物吸附重金属离子的一条有效途径。

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