慢性支气管炎大鼠结肠损害与肺肠组织内皮素表达的相关性研究*

王宝家，杨 宇，唐洪屈，郑秀丽，商绍东，王恩成，陈云慧

(成都中医药大学，成都 610075)

“肺与大肠相表里”的理论源于《黄帝内经》［1］，肺与大肠生理上相互依存，病理上相互影响，治疗上相互为用。临床可根据慢性肺疾病患者出现的证候，运用通腑法治疗肺部疾病取得显著疗效［2，3］。课题组前期研究成果提示，“肺病及肠”的主要病变部位是结肠［4，5］，故本研究观察模型大鼠肺与结肠组织形态学变化，检测胃肠功能及肺肠组织内皮素1(ET-1)含量并进行相关性分析，以探讨慢性支气管炎大鼠结肠损害的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 动物与分组 SPF级雄性SD大鼠60只，由成都达硕生物科技有限公司提供，体质量200±20g，随机分为正常组24只和模型组36只。

1.1.2 主要试剂和设备 (ET-1)Elisa试剂盒(RD公司)，天下秀香烟(川渝中烟工业公司)，烟熏箱(自制纸箱，550mm×330mm×390mm，对侧顶端开孔3cm×8cm)，电子秤(ACS-3H型，中山市金利电子衡器有限公司制造)，高速低温离心机(TGL-16G型，上海科学仪器厂)，电动玻璃匀浆机(DY89-Ⅱ型，宁波新芝生物科技有限公司)，数显恒温水浴锅(HHS型，江苏正基仪器有限公司)，Thermo移液器(ZX1437型，北京艾德豪克国际技术有限公司)，ELx800吸收光酶标仪(Biotek美国伯腾仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 参照前期研究用改良单纯烟熏法造模［8］，正常组置常温无烟室内饲养(室温25℃～26℃，相对湿度50%～70%;模型组大鼠置于饲养笼内，用自制烟熏箱罩住，点燃香烟置于钢丝网上，每份8支，约15min香烟燃尽后放置第二批香烟，每次共24支香烟持续烟熏50min，每天3次(9点、14点和19点)，共烟熏70d。

1.2.2 取材 在造模第20天、第50天、第70天分别随机抽取正常组大鼠8只和模型组大鼠10只，以2.4%水合氯醛麻醉、颈椎脱臼处死，取左肺叶和结肠以10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片(5μm)，行HE染色;取右肺叶和结肠(各约0.2g)匀浆，3000r/min离心 20min，取上清液 1.5ml于－85℃冰箱保存。

1.2.3 胃肠功能检测方法 ①粪便干湿重、粪便含水率:分别在造模第19、49、69天(上午9点)，收集各组大鼠24h粪便颗粒，称重后予以记录，将称湿重后的粪便置于60℃远红外线快速恒温干燥箱中干燥10h，称重并予以记录。粪便含水率(%)=(粪便湿重－粪便干重)/粪便湿重×100%;②胃内残留率与小肠推进率:大鼠处死前禁食24h，用5%炭末与10%羧甲基纤维素钠制成悬混液，各组大鼠以20ml·kg－1的剂量灌胃，30min 后以 2.4%水合氯醛1.2ml～1.4 ml/100g腹腔注射麻醉，取全胃冲洗后称胃全重，清除胃内容物后称胃空重，胃内残留率(%)=(胃全重－胃空重)/胃全重×100%。打开大鼠腹腔分离肠系膜，剪取幽门至回盲部的肠管，不加牵引平铺于玻璃板上，测其全长和炭末前沿至幽门的距离，计算其与全长的百分比，即推进百分率、小肠推进率(%)=(炭末推进距离)/小肠全长×100%。

1.2.4 组织ET-1含量检测 取组织匀浆上清液100μL，按ELISA试剂盒(RD公司分装)说明书操作，检测肺、肠组织ET-1水平。采用ELx800吸收光酶标仪在450nm处读数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性检验采用Spearman检验，P＜0.05为差异有统计学意义，其中P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般表现

正常组大鼠毛色光泽，精神状态、活动度良好，无异常表现。模型组大鼠随着造模时间延长逐渐出现毛色萎黄、不同程度地脱毛、精神不振、活动减少、进食减量、鼻腔分泌物增多、咳嗽、喷嚏等频繁症状。

2.2 肺、结肠组织病理形态观察

正常组第20、50、70天肺和结肠组织均无显著病理改变(见图1～图3)。模型组大鼠第20、50、70天肺和结肠组织出现病理改变的比率逐渐增加，分别为40%、70%和80%。可见支气管上皮细胞变性、坏死，炎细胞浸润，杯状细胞增生，I型上皮细胞线粒体肿胀、内质网扩张，Ⅱ型肺泡上皮细胞增生、毛细血管基底膜增厚，肺泡壁纤维组织增生(见图4);结肠黏膜及黏膜下炎细胞浸润，部分微绒毛消失，线粒体肿胀，黏膜下固有层胶原纤维增生、见成纤维母细胞(见图5、图6)。

2.3 胃肠功能检测结果

图1 正常组70d肺组织(HE×100)

图2 正常组70d结肠组织(HE×100)

图3 正常组70d结肠组织(EM×700)

图4 模型组70d肺组织(HE×100)

图5 模型组70d结肠组织(HE×100)

图6 模型组70d结肠组织(EM×700)

表1显示，与正常组比较，第20天模型组大鼠胃内残留率显著升高，小肠推进率显著降低(P＜0.01)，粪便含水率降低不显著(P＞0.05);第50、70天模型组大鼠粪便含水率、小肠推进率均显著降低(P＜0.01)，胃内残留率显著升高(P＜0.01)。模型组间比较，与第20天比较，第50、70天组大鼠粪便含水率、小肠推进率均显著降低(P＜0.01)，胃内残留率显著升高(P＜0.05);与第50天比较，第70天组大鼠胃内残留率显著升高(P＜0.01)，小肠推进率显著降低(P＜0.01)，粪便含水率显著降低(P＜0.05)。

表1 各组大鼠第20、50、70天胃肠功能测定结果比较(±s)

表1 各组大鼠第20、50、70天胃肠功能测定结果比较(±s)

注:与同时间点正常组比较:＊＊P＜0.01;与模型组第20天比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与模型组第50天比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

时间点 组 别 例数 粪便含水率 胃内残留率 小肠推进率第20天 正常组＊＊△△▲▲8 0.63±0.09 0.32±0.03 0.85±0.04模型组 10 0.62±0.03 0.43±0.03＊＊ 0.73±0.05＊＊第50天 正常组 8 0.66±0.04 0.36±0.01 0.86±0.04模型组 10 0.49±0.06＊＊△△ 0.46±0.04＊＊△ 0.65±0.04＊＊△△第70天 正常组 8 0.63±0.02 0.37±0.02 0.85±0.04模型组 10 0.44±0.04＊＊△△▲ 0.52±0.03＊＊△△▲▲ 0.57±0.03

2.4 肺、结肠组织ET-1含量检测结果

表2显示，与正常组比较，第20天模型组鼠肺组织ET-1含量显著升高(P＜0.01)，结肠组织ET-1含量升高不显著(P＞0.05);第50、70天模型组大鼠肺、结肠组织ET-1含量均显著升高(P＜0.01)。模型组间比较，与第20天比较，第50、70天组大鼠肺、结肠组织ET-1含量均显著升高(P＜0.01);与第50天比较，第70天组大鼠肺、结肠组织ET-1含量均显著升高(P＜0.01)。

2.5 慢支炎模型大鼠肺、结肠组织ET-1水平与胃肠功能各指标相关性

表2 各组大鼠第20、50、70天肺和结肠组织ET-1含量结果比较(±s，ng/L)

表2 各组大鼠第20、50、70天肺和结肠组织ET-1含量结果比较(±s，ng/L)

注:与同时间点正常组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组第20天比较:△△P＜0.01;与模型组第50天比较:▲▲P＜0.01

时间点 组 别 例数 肺组织ET-1含量 结肠组织ET-1含量第20天 正常组8 87.39±6.33 54.89±8.81模型组 10 110.53±4.57* 57.10±6.89第50天 正常组 8 84.32±8.61 52.14±5.89模型组 10 133.32±6.17＊＊△△ 77.79±5.13＊＊△△第70天 正常组 8 81.71±6.72 55.21±9.21模型组 10 154.67±5.26＊＊△△▲▲ 96.64±4.24＊＊△△▲▲

模型组大鼠肺组织ET-1含量与胃内残留率呈正相关(r=0.422，P=0.028)，与小肠推进率呈负相关(r=－0.487，P=0.026);模型组大鼠结肠组织ET-1含量与胃内残留率呈正相关(r=0.459，P=0.017)，与小肠推进率呈负相关(r=－0.487，P=0.026)，与粪便含水率呈负相关(r=－0.282，P=0.043);肺组织ET-1含量与结肠组织ET-1含量呈正相关(r=0.873，P=0.009)。

3 讨论

慢性支气管炎(简称“慢支炎”)是气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症，临床以咳嗽、咳痰为主要症状。慢性支气管炎属中医学“咳嗽”范畴，主要病因病机为外感六淫、脏腑失调、邪犯于肺、肺气上逆。肺与大肠相表里，肺气以降为和，大肠以通为用。肺失宣降、腑气不通则大肠传导失施。《吴鞠通医案·卷二》提到:“痰饮十数日，大便燥结，乃肺气不降，肺与大肠相表里，肺气痹则大肠亦痹。［6］”肺病治肠的理法方药古已有之，如《伤寒论》242条:“喘冒不得卧者，有燥屎也，宜大承气汤。”

内皮素是由内皮细胞合成的具有强烈缩血管作用活性的内源性肽类物质，最早由日本学者Yanagisawa等［7］从猪主动脉内皮细胞中分离纯化出来，是目前发现最强的缩血管物质。内皮素有3种异构体，而活性最强的内皮素1(ET-1)可以使支气管收缩，增强平滑肌细胞的超常增生和增殖，且上调炎症反应。ET-1还能促进成纤维细胞胶原蛋白基因Ⅰ和胶原蛋白基因Ⅲ的表达，促进胶原蛋白沉积，最终导致肺纤维化［8］。ET不仅可由血管内皮细胞合成，也可由胃肠道黏膜上皮细胞合成，ET-1可致大鼠小肠黏膜下血管白细胞黏附［9］。ET-1介导的炎症反应可以使小肠黏膜下微小血管收缩，毛细血管通透性增加，组织水肿、血流量减少，最终引起肠道局部缺血缺氧，组织损伤［10］。

慢性支气管炎的发病与吸烟、大气污染、感染、气候寒冷以及机体内在因素均有关，其中吸烟是公认的最重要引起发病外因。烟草中含焦油、尼古丁和氢氰酸等化学物质，可损伤气道上皮细胞，使支气管黏液腺肥大、支气管黏膜充血水肿、黏液聚集，还可使氧自由基产生增多，诱导中性粒细胞释放蛋白酶，诱发肺气肿形成［11］。烟熏法能较好模拟人类慢性支气管炎的发病过程，且造模容易成功。课题组前期研究表明，无香烟品牌特异性干扰因素［4、5］，故本次实验采用改良单纯烟熏法建立大鼠慢支炎模型。研究结果显示，慢支炎大鼠肺组织ET-1含量显著高于正常组，慢支炎大鼠出现支气管上皮细胞变性、坏死、炎细胞浸润可能与ET-1促进炎症反应有关。肺泡上皮细胞增生、毛细血管基底膜增厚、肺泡壁纤维组织增生可能与ET-1促进成纤维细胞胶原蛋白基因表达有关。模型组大鼠第20、50、70天肺组织ET-1含量逐渐升高，说明随着烟熏干预时间延长，模型组大鼠肺组织损伤越严重。第50、70天慢支炎大鼠结肠组织ET-1含量显著高于正常组，结肠黏膜及黏膜下炎细胞浸润、部分微绒毛消失、线粒体肿胀、黏膜下固有层胶原纤维增生、见成纤维母细胞等，其损害可能与ET-1介导的肠道炎症反应有关。慢支炎大鼠第20天结肠组织ET-1含量较正常组升高不显著，普通光镜和电镜观察结肠黏膜炎细胞浸润不明显，未引起结肠损伤。模型大鼠胃肠功能与肺肠组织ET-1含量有相关性，主要表现在胃内残留率升高和小肠推进率降低，可能与大鼠胃肠损害导致胃排空及肠蠕动功能减弱有关。随着干预时间延长，结肠组织ET-1含量逐渐升高，与肺组织ET-1含量呈显著正相关，且结肠组织病理损害渐趋严重，提示“肺病及肠”的病理传变与肺部病变的时间和程度相关，ET-1可能是介导慢支炎发生结肠病理损害的基础物质之一。

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