益气养阴活血法治疗慢性萎缩性胃炎的实验研究*

于佳宁，林海燕

(1.烟台市牟平人民医院，山东烟台 264100;2.滨州医学院，山东 烟台 264003)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是一种癌变率很高的疾病，尤其伴有异性增生和肠化生等病理改变者常称其为癌前病变。如何寻找一种能有效阻断CAG发展的方法和药物已成为目前研究胃癌一级预防的一个热点。课题组根据长期的临床观察，发现气阴两虚贯穿于本病的始终，为其主要病机，胃络瘀阻为其标，治疗本病当益气养阴活血为法。本课题对益气养阴活血法为主组方的临床经验方剂萎胃康及其拆方进行研究，旨在为益气养阴活血法治疗CAG提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

Wistar雄性大鼠70只，体质量180～200g，由山东大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(鲁)20090001)。

1.2 药物

萎胃康由西洋参20g、白术15g、白芍15g、三七10g、延胡索10g、熊胆5g溶化、甘草5g组成;拆方 I号由西洋参20g、白术15g、白芍15g、甘草5g组成;拆方II号由三七10g、延胡索10g、熊胆5g溶化组成，全部药材均经中药方剂学教研室鉴定符合《中国药典》(2010版)要求。分别取上药量1剂，常规煎煮、过滤，合并2次煎液后将熊胆溶入。在80℃恒温水中，按照动物与人体表比换算法分别浓缩为萎胃康水煎液0.8g生药/mL，拆方 I号水煎液0.55g生药/mL，拆方II号水煎液0.25g生药/mL，制备后冰箱贮存，使用时水浴加热。维霉素糖衣片为湖北绿金子药业有限责任公司产品(批号100903)，用蒸馏水制成0.03g生药/mL的混悬液，制备后冰箱贮存。

1.3 试剂

水杨酸钠为国药集团化学试剂有限公司生产(批号T20100125);兔抗鼠EGF一抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司;兔抗鼠EGFR一抗购自武汉博士德生物工程公司;3%过氧化氢溶液、正常山羊血清工作液、生物素标记的II抗工作液、过氧化物酶-链霉卵白素工作液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 方法

2.1 动物分组与模型建立

将70只Wistar大鼠适应性饲养7d后随机抽取12只作为正常对照组，其余为造模组。正常组正常饲养，造模组大鼠均结合文献［1］采用综合法造模，即2%水杨酸钠溶液2mL/次，ig，连灌6周;ig前、后1h禁食、禁水。前3周自由进食标准鼠饲料、进水;后3周单日禁食，自由饮水，双日足量喂食，自由饮水，进食后于25℃的温水中进行游泳，每次10min。造模过程中死亡4只，造模结束后正常组随机抽取2只，造模组随机抽取4只处死，经病理检查确认模型制作成功，将造模组剩余的50只CAG大鼠随机分为模型组、萎胃康全方组(全方组)、拆方I号组(补益组)、拆方II号组(祛邪组)和西药维霉素糖衣片对照组(西药组)5组，每组10只。

2.2 给药方法

正常组和模型组均灌胃生理盐水，全方组、补益组、祛邪组和西药组分别灌胃萎胃康水煎液、拆方I号水煎液、拆方II号水煎液和维霉素混悬液，1mL/次/d，连续用药30d，每周称体质量1次，根据体质量调整用药量。

2.3 标本采集与检测

实验结束后，各组动物禁食不禁水24h后，5%戊巴比妥钠按50mg·kg－1ip麻醉后，快速剖取全胃标本，沿胃大弯剪开胃体，用生理盐水洗去胃内容物后，取胃小弯侧胃窦部0.5cm×2cm大小胃组织置于10%的甲醛中固定，石蜡包埋，连续切片3张，切片厚 5um，分别做 HE染色，表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)免疫组化SP法染色。具体染色步骤如下:切片脱蜡至水;微波进行抗原修复;PBS洗涤5min×3次，3%H2O2封闭内源性过氧化酶;PBS洗涤5min×3次，加入山羊血清封闭非特异性抗原，吸去多余血清加入一抗，4℃ 孵育过夜;PBS洗涤5min×3次，滴加生物素标记的二抗孵育20min;PBS洗涤5min×3次，加入过氧化物酶-链酶卵白素孵育;PBS洗涤5min×3次，DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明、中性树胶封片。一抗效价均为1∶100，均以PBS代替一抗做阴性对照。

2.4 统计学方法

应用SPSS 17.00软件进行统计分析，所有资料用均数±标准差(±s)表示，计量资料组间进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠胃黏膜光镜下病理组织学改变

正常组大鼠胃黏膜上皮完整，细胞排列整齐，呈单层柱状，腺上皮与腺管分界清楚，固有膜腺体饱满清晰，未见萎缩脱落或缺损，胞浆透明(见图1-①)。模型组大鼠胃黏膜层变薄，不完整，多数腺体结构排列紊乱，有不同程度的萎缩或消失，有弥漫或灶性淋巴细胞、浆细胞浸润，细胞大小形态不一(见图1-②)。全方组大鼠胃黏膜上皮排列规整，腺体大小形态一致。肌层逐渐增厚，厚薄较均匀(见图1-③)。补益组黏膜病变有所恢复，上皮细胞相对完整，腺体排列稍欠规整，表层黏膜无脱落，固有膜中的炎细胞浸润显著减少(见图1-④)。祛邪组和西药组胃黏膜腺体细胞数量较模型组明显增多，胃黏膜结构紊乱程度较模型组轻(见图1-⑤、1-⑥)。

图1 各组大鼠胃黏膜光镜下病理表现比较(HE，×100)

图2 萎胃康及其拆方对CAG大鼠胃黏膜EGF表达的影响

图3 萎胃康及其拆方对CAG大鼠胃黏膜EGFR表达的影响

3.2 各组大鼠胃黏膜EGF、EGFR的表达

EGF染色的阳性部位主要出现在细胞膜和细胞质，呈棕黄色(图 2-①、2-②、2-③)。EGFR 染色阳性部位也主要在细胞膜和细胞质，呈棕黄色(图3-①、3-②、3-③)。表 1 显示，各组胃窦黏膜 EGF、EGFR表达的比较。

4 讨论

近年来，表皮生长因子(EGF)与胃黏膜疾病的关系成为研究的热点。有人发现EGF在胃癌和中重度萎缩性胃炎患者的胃黏膜中表达增强，提出EGF可能参与CAG癌变的观点［2］。认为EGF的正常表达可引起胃黏膜增殖，对CAG患者胃黏膜病变的愈合具有重要作用。一旦表达过度，就会使细胞异常增生，异常增生的细胞容易发生变异，并有逐步恶性表型转化的趋势，使细胞密度相关抑制活性消失、代谢增强，促进某些病毒和化学物质的致癌作用［3］。

表1 萎胃康及其拆方对CAG大鼠胃黏膜EGF、EGFR表达的影响(±s，n=10，×10－2)

表1 萎胃康及其拆方对CAG大鼠胃黏膜EGF、EGFR表达的影响(±s，n=10，×10－2)

注:与正常组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01;与全方组比较:3)P＜0.01，4)P＜0.05;与补益组比较:5)P＜0.01，6)P＜0.05

组 别 剂量/g·mL －1 EGF平均光密度EGFR平均光密度正常组 —11.78±2.18 12.34±1.37模型组 — 18.27±1.431) 20.49±1.311)全方组 0.80 12.27±2.562) 14.44±0.862)补益组 0.55 13.36±2.132) 15.75 ±1.322，4)祛邪组 0.25 13.68 ±0.972) 17.29 ± 1.382，3，5)西药组 0.03 15.15 ± 1.502，3，6) 16.89 ± 1.252，3，5)

表皮生长因子受体属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶，对EGF具有高度亲和性，是癌基因c-erbB-1的表达产物。在胃癌、头颈癌、前列腺癌等在内的多数恶性肿瘤上皮有高表达，与肿瘤的进展、血管生成、转移扩散等均密切关系。其与EGF结合后，能引起自身磷酸化和细胞内酪氨酸残基磷酸化，激活酪氨酸激酶，继而促发细胞分裂信号，引起细胞分裂。而此种过度增生的细胞易发生变异并可逐步向恶性表型转化。EGFR不同程度的表达，可能调节和刺激细胞增殖，促进有丝分裂并向癌发展［4］。

本实验研究发现，模型组EGF、EGFR表达水平明显高于正常组，这与国内报道在人群中的表达情况是一致的［5］。可能是致模过程刺激下使内源性EGF分泌增加、受体激活，通过其修复、增殖作用，来保护胃黏膜抵御各种致炎因子的侵袭，以利于胃黏膜再生修复。提示在实验刺激控制下的CAG大鼠有反应性EGF、EGFR表达升高，EGF、EGFR可能参与慢性萎缩性胃炎的发生、转化过程。经各中药和维酶素治疗后，EGF、EGFR表达明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，以全方组效果最好，其次是补益组。

分析萎胃康及其拆方治疗CAG的机制可能是:一方面诱导、促进细胞的分化成熟。经H-E染色、光镜观察我们发现，经治疗后胃黏膜萎缩、肠化与模型组比较均显著下降，提示可能与诱导和促进肠化细胞、异型增生细胞的分化成熟，阻止其发生癌变或使其逆转为正常有关;另一方面抑制细胞的异常增殖，从而有利于黏膜细胞的更新及损伤后的修复，调节胃黏膜细胞增殖水平恢复正常，其确切的机制尚有待进一步的研究。

［1］张淑芹，赵林山，郑继奎，等.慢性萎缩性胃炎动物模型的复制［J］.哈尔滨师范大学自然科学学报，2001，17(6):81-83.

［2］吴加国，姚健敏，曹倩，等.表皮生长因子对SD大鼠萎缩性胃炎的作用［J］.中华内科杂志，2001，40(3):169-172.

［3］袁红霞，赵强，黄文政，等.善胃方对气阴两虚型胃癌前期病变 EGF 及 EGFR 的影响［J］.天津中医药，2004，21(1):9-12.

［4］刘正新，陈宝雯，杨桂彬，等.不同胃黏膜病变的细胞增殖变化规律及其意义［J］.中华内科杂志，2004，43(8):580-583.

［5］曹京旭，孔可，苏久莲，等.慢性萎缩性胃炎患者血清TNF、IL-2及hEGF含量测定及临床意义［J］.沈阳部队医药，1997，10(5):413-414.