凝乳酶在干酪生产中的应用

文 / 刘显庭 张 昊 郭慧媛 任发政

（中国农业大学教育部-北京市共建功能乳品重点实验室）

干酪是以乳、稀奶油、脱脂乳或部分脱脂乳、酪乳或这些原料的混合物为原料，经凝乳并排出乳清而制成的新鲜或发酵成熟的乳制品。按不同的凝乳方式，干酪可分为酶凝型干酪与酸凝型干酪。目前，大部分干酪属于酶凝型干酪，即通过凝乳酶的作用促进凝乳的形成。凝乳酶的作用关系到干酪品质的好坏与干酪生产的经济效益，在干酪生产中的作用至关重要。目前，随着干酪产量的快速增长，传统的小牛皱胃凝乳酶的生产已经处于供不应求的状态，探寻新来源凝乳酶成为了目前研究的热点。

1 凝乳酶概述

凝乳酶在干酪生产中的使用可以追溯到约公元前6000年，旧石器时代的人们用小牛的皱胃作为容器盛装牛乳的过程中发现牛乳凝集现象，从而使得皱胃凝乳酶在干酪生产中的应用成为了可能[1]。凝乳酶按来源可分为动物性凝乳酶、植物性凝乳酶、微生物凝乳酶、基因工程重组凝乳酶四类。

动物性凝乳酶是一类传统的凝乳酶，主要从新生反刍动物如小牛的第四个胃即皱胃中提取。目前，由于小牛皱胃酶等动物性凝乳酶在干酪生产中得到广泛地应用，从反刍动物中获取小牛皱胃酶等动物性凝乳酶已经实现大规模生产[2]。一般从新生小牛皱胃中提取的皱胃酶由凝乳酶（EC 3.4.23.4）及部分胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）、胃蛋白酶B（EC 3.4.23.2）、胃亚蛋白酶（EC 3.4.23.3）组成，这类酶都属于天冬氨酸蛋白酶（EC 3.4.23）。皱胃酶包含凝乳酶与胃蛋白酶，其比例受小牛生长期、饲养情况影响，在饲养条件良好的情况下小牛皱胃中凝乳酶所占的比例可大于80%[3]。目前生产用皱胃酶中凝乳酶的比例在50%～90%。凝乳酶能特异性水解Κ-酪蛋白产生酪蛋白巨肽，从而形成凝乳，而胃蛋白酶的水解特性并不专一，它能同时水解含有Phe，Tyr，Leu，Val的肽键[4]。动物凝乳酶的凝乳活力与蛋白水解能力高，是目前干酪生产中首选的凝乳酶，但是随着世界干酪产业不断发展壮大，通过宰杀犊牛以获得凝乳酶的方法已经无法满足生产的需要，因此亟待开发新来源的凝乳酶。植物性凝乳酶、微生物凝乳酶、基因工程重组凝乳酶都属于新来源凝乳酶。

植物性凝乳酶是从植物的组织中水浸提取出的一类具有凝乳作用的蛋白酶，目前被广泛认为具有替代传统凝乳酶的潜力。常见的从无花果树类中提取的蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物性凝乳酶的蛋白水解能力较弱，不能应用于干酪生产中[5]。但是少数植物性凝乳酶在干酪生产中的应用已经较为广泛，如地中海大蓟，其在传统干酪生产中的应用已有数世纪的历史[6]。

微生物凝乳酶是微生物代谢作用产生的一类具有凝乳作用的蛋白酶，能部分应用于生产中。与传统的皱胃酶相比，微生物凝乳酶的生产周期短，产量大，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶成本较低。同时，由于宗教信仰的原因，微生物凝乳酶生产的干酪更受素食主义者的青睐。目前微生物凝乳酶的主要来源是米黑根毛霉，其作为动物性凝乳酶的替代已长达40 年。随着分离与纯化技术的提高，此类凝乳酶已为素食主义者所接受并应用于有机干酪的生产中。但是微生物凝乳酶对蛋白酶的高降解能力易导致干酪的产率下降。

基因工程重组凝乳酶一般表示为发酵生产凝乳酶（FPC），是利用基因重组技术生产的一类具有凝乳作用的蛋白酶。自1990年利用重组DNA技术发酵生产凝乳酶的方法得到美国FDA认证以来，基因工程发酵生产凝乳酶在美国广泛应用并在世界范围内逐渐被接受，2006年发酵生产凝乳酶市场份额占有70%～80%[7]。但是，基于安全的考虑，此类凝乳酶生产的干酪仍然不被部分消费者所接受。

由于受反刍动物种类、年龄、饲养等的影响，凝乳酶的理化性质往往不恒定，而在一定的范围内。如表1所示，凝乳酶的分子量在31～40 kDa之间，其活性同时受pH值和温度等的影响。研究表明，凝乳酶在pH值5.5～6.0下最为稳定，在pH值 3～4之间，凝乳酶自动降解而迅速失活，在pH值>9.8时凝乳酶则发生不可逆转的结构变化而失去活性。当凝乳酶所处温度从45 ℃升到55 ℃时活性迅速降低，当温度达到55 ℃时凝乳酶活性即丧失。凝乳酶性质的差异影响了干酪的品质，因此应当对不同类凝乳酶的成分进行测定，对其凝乳活力标准化，以供干酪生产中参数的调整。

表1 动物性凝乳酶中蛋白酶的主要特征

2 凝乳酶在干酪生产中的作用

2.1 凝乳酶促进凝乳的形成

凝乳酶在促进凝乳过程中的主要作用对象是酪蛋白。酪蛋白约占牛乳中蛋白质含量的 80%，可分为 αs1、αs2、β 和 Κ-酪蛋白，其质量比约为 4︰1︰4︰1.3[14]。牛乳中这四种酪蛋白单体会与磷酸钙相互结合成直径约为100～300 nm的胶束结构[15～16]。目前，关于酪蛋白胶束的结构尚无定论，但是大都认为其由疏水性的αs-酪蛋白、β-酪蛋白构成了胶束内部，由亲水性的Κ-酪蛋白组成其外部。其中，αs-酪蛋白、β-酪蛋白带有多个磷酸根基团对Ca2+敏感，能与Ca2+桥接形成稳定的内部结构，而Κ-酪蛋白只有一个磷酸根基团，并使Ca2+桥接终止，形成稳定的毛发层结构。同时，毛发层的Κ-酪蛋白由副Κ-酪蛋白与带有负电的酪蛋白巨肽组成，从而使胶束表面带有负电荷。酪蛋白胶束之间通过胶束间毛发层的空间位阻作用与静电斥力而稳定存在于牛乳中。

在凝乳的过程中，通过凝乳酶的作用可以破坏原本稳定的酪蛋白胶束结构，使得胶束之间发生聚集而形成凝乳。凝乳酶对酪蛋白胶束的作用在于特异性的作用于Κ-酪蛋白的第105～106 位的肽键位点，水解Κ-酪蛋白成酪蛋白糖巨肽与副Κ-酪蛋白。随着带负电的酪蛋白糖巨肽释放至乳清，酪蛋白胶束表面的负电荷减少，胶束间的静电斥力下降，毛发层切除致胶束间的空间位阻降低。最终，酪蛋白通过疏水键合与Ca2+架桥作用聚集，从而形成凝乳[17]。

不同类的凝乳酶由于水解酪蛋白的能力有所不同，所以凝乳酶作用形成凝乳的时间不同，达到切割时所需弹性模量值的凝乳酶量也不同。Kappeler等人利用基因重组技术合成的一类多肽的活性是传统凝乳酶活性的两倍，所需凝乳时间短，酶量少。因此，为使生产工艺标准化，必须根据凝乳酶的活力对凝乳酶的使用量进行适当的调整。凝乳酶的活力是指凝乳酶分解Κ-酪蛋白的能力，是凝乳酶最重要的性质之一。传统的凝乳酶活力测试方法为Soxhlet法，即35 ℃下一体积凝乳酶溶液在40 min内使牛乳形成凝乳的体积[18]。目前，针对山羊凝乳酶、小牛凝乳酶与微生物凝乳酶，已经分别建立ISO/IDF199、ISO/IDF157 、ISO/IDF176等凝乳酶活力的测定标准。在32 ℃、pH值6.5下，将牛乳标准化后作为作用基质，测定凝乳酶与标准蛋白酶的凝乳活力并进行比较，凝乳酶的活力单位表示为国际凝乳活力单位（IMCU）。最近的研究中，Cortellino等人利用高效液相色谱法分离了小牛皱胃酶中的胃蛋白酶与凝乳酶，并测定了其活力。其结果与IDF标准使用的方法比较并无差异，说明IDF标准所使用的方法可靠、简便、迅速，能准确地反映出凝乳酶的活力[19]。

2.2 凝乳酶对干酪成熟期蛋白水解的影响

除促进凝乳形成外，凝乳酶对于干酪独特风味的形成有着重要的作用。在凝乳形成后，大部分凝乳酶会随着乳清而排出，而只有少量的凝乳酶残留在凝块当中，凝块当中凝乳酶的量受凝乳酶种类、排乳清时温度、pH值及凝块水分的影响，在0%～30%范围内[20]。在干酪的成熟期，随着pH值与NaCl浓度的变化，残留的凝乳酶会作用于αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白的多个键位，使其分解形成短肽与氨基酸。目前有关凝乳酶如何影响干酪成熟期的报道较多，其共同表明凝乳酶主要在成熟的早期起作用[21～22]。有研究表明，将凝块加热至45～60 ℃后，干酪成熟期的αs-酪蛋白降解明显减少，说明凝乳酶加速了αs-酪蛋白的降解[23]。Hynes等人的研究表明，αs-酪蛋白的降解速度与凝乳酶的使用量直接相关，且αs-酪蛋白对于软质奶酪特征风味与质构具有很大作用，而在硬质或半硬质干酪的生产中，残留凝乳酶的活力多由凝块的加热温度决定[24]。

凝乳酶的种类影响了干酪风味的形成，2009年Bansal的研究表明，基因工程凝乳酶与小牛皱胃凝乳酶相比，二者在组分与产品pH值上无差异，而在αs-酪蛋白的降解上，小牛皱胃酶的苦味、硫磺味较弱[25]。即使同属于动物性的凝乳酶也存在着明显差异，2004年Prieto用小山羊皱胃凝乳酶替代小牛皱胃凝乳酶，其结果表明αs-酪蛋白的降解明显减弱，成熟过程中干酪三氯乙酸可溶性氮含量的增加延迟[26]。因此，凝乳酶的种类、成分对干酪成熟期蛋白质的分解有显著的影响。

由于部分凝乳酶特别是糊状凝乳酶中还含有脂肪酶等，因此还能分解乳脂肪产生游离脂肪酸。有研究表明，在部分意大利干酪如菠萝伏洛干酪、佩科里诺干酪的生产中，在脂肪分解酶的作用下形成了干酪的特征性风味[27]。Virto等人发现在羔羊皱胃酶内的脂肪分解酶作用下，脂肪分解产生游离脂肪酸，从而形成了干酪锐利、辛辣的风味[28]，并使游离氨基酸的释放延迟[29]。这种脂肪酶包含前胃酯酶与胃酯酶，其活性与羔羊的饲养等因素有关，有研究指出在饲料中加入益生菌后，从羔羊皱胃中提取的糊状凝乳酶中脂肪酶的活性增高[30～31]。

3 凝乳酶在干酪生产中的应用现状

联合国粮农组织的数据显示，1961～2010年期间，世界干酪生产量平均年增长率达3.5%，高增长的干酪需要更多的凝乳酶。但是由于新生小牛皱胃数量有限，使得目前凝乳酶的生产供不应求，小牛皱胃凝乳酶仅能满足凝乳酶的需求量的20%～30%[32]，约80%的小牛皱胃酶用于传统干酪的生产中。最近几年来，对于其它反刍动物皱胃酶尤其是小羊皱胃酶的研究逐渐成为热点，但一直未商业化生产。有研究在具有原产地保护的意大利菠萝伏洛干酪中使用小羊皱胃酶，其结果表明，由于小羊皱胃酶含有脂肪分解酶从而分解脂肪产生游离脂肪酸，使干酪形成锐利、辛辣刺激的风味[33]。因此，尽管传统的动物性凝乳酶在市场上供不应求，但是由于不同类的凝乳酶作用不同，特别是对于形成特征性风味的作用有差异，消费者习惯了传统干酪的风味而不能接受这类酶在干酪中应用。因此，有些传统的凝乳酶在有原产地保护标志干酪的生产中仍具有不可替代的作用。

然而在我国由于干酪产业的起步较低，目前生产重心主要停留在再制干酪加工与进口产品的分装上，且传统干酪如云南乳扇、广东姜撞奶等属于酸凝型干酪，对凝乳酶的需求量较小。因此，凝乳酶在我国尚未实现产业化生产。但是随着我国奶业的高速发展与乳制品生产结构的调整，干酪已经成为中国乳品产业研究开发的热点及新的消费增长点。而凝乳酶作为干酪生产用的酶制剂，在干酪生产的带动下也必将成为我国研发与生产的重点之一。

4 小结与展望

凝乳酶对于干酪的生产至关重要，凝乳酶是食品工业中最为重要的蛋白酶。在目前凝乳酶短缺的情况下，为开发具有高凝乳活力，低蛋白水解力的凝乳酶，亟待开展有关新来源凝乳酶在促进凝乳形成，促进干酪独特风味形成中作用的研究。同时，随着研究的不断深入，在原产地保护干酪生产之外，发酵生产凝乳酶的应用必将成为今后产业发展的新方向，也必将对干酪产业产生巨大的经济效益。

【基金支持：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD12B08，2011AA100903）】

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