牛乳中嗜冷菌检测方法的研究进展

文 / 庞伟华

（黑龙江立高仪器设备有限公司）

随着乳品加工业的发展，企业对生奶的需求量逐渐增加，为了防止生奶的变质而广泛采用冷藏方法来保存生奶。用这种方法保存生奶会导致生奶中嗜冷菌达到一定的数量。嗜冷菌可以抵御极端的寒冷环境，如南极的沿海冰层。嗜冷菌之所以可以在冰点下存活与繁殖，是因为它们有一种特殊的脂类细胞膜。这种细胞膜在化学上可以抵御由极寒带来的硬化，使得其内蛋白质呈现出“抗冻能力”[1，2]。

嗜冷菌中最常见的品种有耶氏菌、李斯特菌和假单胞菌。人们对嗜冷菌的生长特点研究较少，主要集中在嗜冷菌所产生的酶的作用机制上。影响酶稳定性的因素包括离子数量的增加、结构大小和孔洞数量的减少，特定氨基酸的改变和亚基间疏水作用的增强等[3]。嗜冷菌对热敏感，一般在UHT灭菌过程中被杀灭，但其代谢产生的酶耐热，即使在超高温灭菌140 ℃，5 s仍有残留（蛋白酶的残留量为29%，脂肪酶的残留量为40%)。其中脂解酶大部分和酪蛋白结合，当乳冷却时从酪蛋白部分转至脂肪，引起牛乳脂肪水解[4]。研究表明，当生奶中嗜冷菌数量超过1×106CFU/mL时，产生的蛋白酶和脂肪酶将导致超高温产品发酸，出现脂肪氧化味。根据实际经验，生产UHT乳制品的生奶，嗜冷菌数需控制在1×103CFU/mL以内[5]。国外早在20世纪80年代，在乳品生产过程中己经建立了完善的嗜冷菌检测体系。我国在乳品生产过程中，对嗜冷菌的控制还没有引起足够的重视。近年来由食品卫生问题而导致的多起消费事件，导致人们对食品的安全性提出了更高的要求，对嗜冷菌的关注度也逐渐提高。

1 嗜冷菌的耐低温特性

嗜冷菌由于其细胞结构、生物大分子等对低温有较强的适应能力，因此在低温下能生长。嗜冷菌细胞膜中脂类含量较多[6]，有助于其在低温条件下吸收环境中的营养物质。而且其中含有较多不饱和脂肪酸[7]，降低了脂类的溶点。低温条件下，嗜冷菌可以通过改变细胞外膜蛋白质结构，使通道孔径缩小，避免有毒物质进入体内。嗜冷菌中二氢脲嘧啶含量高，有助于tRNA局部构象，有较好的柔性以及动力学上较好的流动性，以适应低温。嗜冷菌所产低温酶的分子结构一般具有较高的柔性，在低温条件下能快速进行构象上的调整以适应催化反应的需要，减少能量消耗，进而使嗜冷菌保持正常生长所需的新陈代谢活动[8]。当嗜冷菌所处环境温度由21 ℃降到5 ℃时，细胞内可产生26 种冷休克蛋白。冷休克蛋白的作用可能是通过与DNA和RNA相互作用来促进一些嗜冷菌在低温条件下生长所需蛋白质的合成[9]。

2 嗜冷菌对原料奶的危害分析

嗜冷菌主要来源于外源性污染，如牛体、奶站环境、挤奶器具、冷藏奶及运奶的器具、工作人员的卫生状况等，管理对嗜冷菌的控制有较大影响。原料奶中以兼性嗜冷菌为主，目前从原料奶中分离到的嗜冷菌有假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆属、黄杆菌属和克雷伯氏杆菌属等[10]。对这些菌株进行特性分析后发现，它们都会对原料奶的保存产生危害。如假单胞菌，具有强力分解脂肪和蛋白质的能力，可使脂肪分解从而产生脂肪哈败味，可将原料奶中的蛋白质分解成蛋白胨；产碱杆菌，其本身不能分解原料奶中的糖类产酸，但其能产生灰黄色、棕黄色的色素，并可使原料奶中所含的有机盐分解而形成碳酸盐，从而使原料奶转变为碱性，并能导致乳制品产生粘性变质。总之，嗜冷菌能破坏原料奶中的成分，主要是由于嗜冷菌可以产生使脂肪、蛋白质分解的耐热脂肪酶、蛋白酶[11]。另外，嗜冷菌在有氧低温下可进行生色反应，如黄色、绿色、奶油色、金色、红色、棕褐色和黑色等。在原料奶运输和储存过程中，搅拌和长时间摇晃能使嗜冷菌生长速度加快，所以在制冷运输过程中应该尽量避免长时间搅拌和反复入罐；在条件允许的情况下，尽量将牛奶的制冷温度调整至2 ℃储存，将牛奶运输到厂的温度控制在4 ℃以下。这样可以有效控制嗜冷菌的繁殖，提高原料奶质量；同时，尽量缩短原料奶的储存时间，在现有条件下将24 h到厂时间缩减至16 h左右，也是控制嗜冷菌繁殖的有效手段。

3 嗜冷菌对UHT奶的危害分析

嗜冷菌产生的热稳定性胞外降解性酶类在巴氏杀菌过程中基本不受影响，经过UHT处理后仍能保持部分活性，导致UHT乳蛋白凝块和乳清析出。随着UHT乳贮存时间延长，首先会出现少量小凝块，然后逐渐增大并沉于底部，而上部则析出少量的乳清液。这主要是酶水解乳蛋白引起的，主要水解κ-CN生成副-κ-CN，从而失去了κ-CN对蛋白质的稳定作用，使蛋白质聚集，最终由于自身重力作用沉于底部，随时间的延长，并逐渐析出乳清[12]，同时产品发苦，在水解过程中释放的氨基酸会使褐变反应加剧。脂肪酶分解原料奶中的脂肪球，产生游离的短链脂肪酸使原料奶酸度升高导致腐败，由于游离脂肪酸的增加，导致脂肪上浮，乳制品风味变差，产生乳酪味、腐烂味、肥皂味、不洁味或酵母味等[13]。这些由嗜冷菌产生的脂肪酶、蛋白酶还会造成片式热交换器的淤塞，使清洗困难。

4 国内外嗜冷菌检测方法研究现状

由于原料奶中嗜冷菌对高温杀菌的乳制品影响较大，因此对于原料奶中嗜冷菌的检验是非常重要的。IDF Standard 101A中嗜冷菌数的检测方法为：将原料奶在5~7 ℃培养10 天后计数；IDF Standard 132A中嗜冷菌数的检测方法为：将样品在21 ℃下增菌培养后，采用选择性培养基在21 ℃培养25 h后，将样品中革兰氏阴性杆菌作为嗜冷菌污染的指标。但这些方法所需的检测时间长，因此对原料奶的收购没有指导性意义。因此，国外研究者不断对嗜冷菌的检测方法进行研究和改进，以期得到既快速又准确，而且适合工业化应用的检测方法。

4.1 PCR-ELISA法

Gutiérrez等在20世纪90年代将PCR技术和ELISA技术结合用于测定冷藏牛奶中细菌的数量。他们找出了一个广泛存在于冷藏原料奶中的微生物中的DNA片段。实验表明，当细菌数在103～107CFU/mL时，PCR-ELISA检测方法中样品的DNA扩增吸光度效果最好，而且在测定4 ℃下保存的原料奶中嗜冷菌的数量时，与传统的标准平板计数培养法之间存在很高的相关系数（r=0.94，p＜0.001）[14]。PCRELISA方法最突出的优势在于节省时间，该方法检测全部样品需要的时间为24 h。PCR-ELISA方法具有很高的特异性和敏感度。Sharpe等[15]和Fung等[16]认为PCR-ELISA这种基于免疫学和基因技术的方法提供了一种互补的、创新的途径来检测食品中的微生物，不但减少了分析的时间，而且仍然可以保持高的可靠性和敏感度。

4.2 氧化还原法

用选择性试剂二氯甲基苯翁和细菌指示剂四唑盐混合在一起在30 ℃培养，四唑盐会被还原，使样品奶的颜色变成红色。变色需要的时间决定样品奶中低温菌的数量与存在的活性[17]。

4.3 酶联免疫吸附技术

此方法是基于酶反应的一种高特异性和高灵敏性的检测方法，它可以从复杂的样品体系中特异地与目标反应物结合，从而达到检出的目的。Rosalba等利用单克隆抗体和间接ELISA的方法测定了冷藏奶中的嗜冷菌，并且与嗜冷菌的平板计数法进行比较。实验结果表明，测定4 ℃下保存的成品奶样品中嗜冷菌，平板计数法和ELISA方法之间存在非常好的相关系数[18]。

4.4 氨肽酶法

Susana等测定了冷藏原料奶的微生物。他们用无色L-丙氨酸-p-对硝基苯胺作为底物，通过嗜冷菌细胞壁的氨肽酶的作用使其裂解成p-硝基苯胺（黄色），最后用紫外分光光度计测定吸光度，间接反映样品中嗜冷菌的数量。实验结果表明，氨肽酶法和传统的微生物计数方法之间存在很高的相关性，所需的检测时间约为2.5 h，仪器和实验操作简单[19]。

4.5 脂肪酶活性的测定

任静等研究出了一种新的检测方法。方法的原理为：嗜冷菌能在奶中产生大量耐热性脂肪酶，在脂肪酶和嗜冷菌之间建立一种线性关系，利用4-硝基苯酚游离释放法测定脂肪酶的活力，从而间接反映嗜冷菌的数量。实验结果表明，总菌数和酶活之间存在的线性关系极显著[20]。

5 结语

为了生产高质量的乳制品，原料奶中的嗜冷菌的检验是尤为重要的。开发快速、准确、操作简单、价格低廉的嗜冷菌检验方法是未来乳品企业重点研究的课题之一。检验方法的开发是保证产品质量的关键，但是却增加了生产成本，并且具有滞后性，而且不能指导高质量原料奶的生产和加工，因此，对于原料奶的早期生产控制更是乳品行业最需要考虑的问题。

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