TH17细胞、IL－21因子在鼠肺纤维化中的表达及意义

于永江，李树民，鲍文华，梁建合，阎红娥，孙云晖

（佳木斯大学附属第一医院 呼吸内科，黑龙江 佳木斯154002）

肺纤维化是一种复杂的进行性病变，致病因素多、步骤复杂，基本上是不可逆的病理改变［1，2］。目前治疗方法有限，预后差，死亡率高，被称为不是肿瘤的肿瘤。病因及发病机制尚不清楚，国外学者研究提示，多种炎症因子可能参与了肺纤维化的发生、发展［3］。最近发现的一种新的效应性CD4＋T细胞亚群Th17细胞，以分泌IL－17为特征性细胞因子，还可分泌IL－21、IL－22和IL－26等多种细胞因子，在防御细菌的胞外感染、介导慢性炎症和自身免疫性疾病、肿瘤等过程中发挥重要作用［4，5］。IL－21对 T细胞、B细胞、NK细胞和DC等免疫细胞发挥作用，参与机体的获得免疫与天然免疫［6］。我们前期工作发现Th17细胞及IL－17参与肺纤维化动物模型的发病过程。本次实验检测博来霉素致大鼠肺纤维化模型不同发病阶段肺组织中Th17细胞、IL－21因子表达水平，探讨在其发病过程中的作用及机制。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 健康SPF级SD大鼠64只，雌雄各半，体质量（210±20）g，3－4月龄，由大连医科大学动物部提供，许可证号：动物合格证号ISCXK（辽）2008－0002分笼饲养于SPF级环境中。

1．1．2 试剂和仪器 注射用盐酸BLM，15mg／支，日本化药株式会社生产 ；HYP试剂盒购于天津市金圣生物试剂公司；IL－21的引物由上海生物工程有限公司合成，如下所示：beta－actin（784bp）：上游5′－AAGAGAGGCATCCTGACCCT－3′，下 游 5′－GAGCCAGGGCAGTAATCTCC－3′；IL－21 （142 bp）上游 5′－CCTCAGCTGTGCCAACAAGTC－3′，下 游 5′－TCCTGAACTTCTAACAGCTCCACA－3′；大鼠抗小鼠单克隆流式抗体 APC Mouse Anti－Rat CD3、PerCP Mouse Anti－Rat CD8a、抗大鼠／小鼠单克隆抗体 Anti－Mouse／Rat IL－17AFITC 及同型对照、固定／破膜剂、Lysing Buffer溶血素（美国BD Pharmingen公司）均购于北京利文公司；胶原酶ⅤCollagenaseⅤ、离子霉素、PMA（美国Sigma公司）均购于北京利文公司。

1．2 方法

实验分组与造模：采用随机数字法将64只SD大鼠均分为N、P、D 3组。P、D组均采用一次性气管内注射博来霉素（5mg／kg）方法建立大鼠肺纤维化模型。对照组气管内灌注等量0．9%氯化钠注射液。D组从第7天开始每日腹腔注射地塞米松注射液（3mg／kg），N、P组腹腔注射0．9%氯化钠注射液。

1．2．1 标本取材 分别于造模第7、14、28天每组随机取8只大鼠处死，留取左肺分为两份，一份通过苏木精－伊红染色（HE）观察肺组织病理变化和 另一份取20mg肺组织 检测其HYP含量，取右肺组织，留取80mg肺组织采用胶原酶Ⅴ消化法制备肺组织单细胞悬液，采用流式细胞技术检测Th17细胞百分比。另取右肺组织100mg，放入－196℃液氮中保存，用于RT－PCR评估IL－21mRNA的表达水平。

1．2．2 采用碱水解法测定肺组织HYP含量 严格按照试剂盒说明书进行。

1．2．3 流式细胞分析法检测肺组织中Th17 ①采用胶原酶Ⅴ消化法制备浓度1．0－3．0×107个／L肺单细胞悬液。②刺激培养淋巴细胞：加：PMA（50 μg／ml）、离子霉素Ionomycin（lug／ml），BFA（1μg／ml）；（37℃、5%CO2、孵育5h）③收获细胞，细胞膜表面染色：用抗鼠CD3＋、CD8＋抗体60μl／份样本、染色，室温避光15min；加入2ml PBS洗涤离心去上清。④破膜通透：加入0．25ml破膜剂混匀10 min后终止破模；加PBS0．5ml上机观察CD3＋CD8－细胞数；如果数量较为理想，取4万细胞做阴性对照，离心去上清。⑤加PE标记的抗人IL－17，室温避光孵育30min，洗涤后上机；⑥根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，设置各通道之间的荧光补偿后，对Thl7细胞的比例进行检测。

1．2．4 RT－PCR肺组织IL－21mRNA 的表达 提取肺组织总RNA，反转录为cDNA。目的基因IL－21mRNA 的 上 游 引 物：5′－CCTCAGCTGTGCCAACAAGTC－3′，下 游 引 物 5′－TCCTGAACTTCTAACAGCTCCACA－3′扩增片段142bp；内参照 B－Actin mRNA 上 游 引 物：5′－AAGAGAGGCATCCTGACCCT－3′，下 游 引 物 5′－GAGCCAGGGCAGTAATCTCC－3′，产 物 长 度 784bp。PCR反应条件按试剂说明进行。凝胶成像系统，Total Lab图像分析系统测定各组IL－21mRNA反转录扩增条带的积分吸光度值。

1．2．5 统计学方法 采用SPSS19．0统计软件进行分析。实验结果以均数±标准差（¯x±s）表示。多组均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD－t检验，检验水准α＝0．05，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 大鼠的组织病理学改变及羟脯氨酸含量变化

2．1．1 HE染色 N组病理切片显示大鼠肺组织结构无异常，间质未发现胶原沉积。造模第7d，P组大鼠肺组织显示明显的肺泡炎，有大量炎性细胞渗出肺泡腔，有少量胶原沉积于肺间质；模型组第14d，P组肺泡炎减轻，成纤维细胞增生、胶原沉积、肺泡间隔增宽，肺泡腔缩小。模型组第28d，P组肺纤维化形成稳定，有部分炎症细胞浸润。D组也出现从肺泡炎到肺纤维化的变化过程，但变化程度同一时间点较P组轻（P＜0．05），见图1。

2．1．2 大鼠肺组织中羟脯氨酸含量变化 N组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量随时间变化无改变。P组和D组大鼠肺组织内羟脯氨酸含量随时间延长逐渐增加。P、D组羟脯氨酸含量均高于N组（P＜0．05），相同时间点，D组羟脯氨酸含量低于P组（P＜0．05），见表1。

图1 大鼠肺组织病理学改变

表1 大鼠肺组织羟脯氨酸含量（¯x±s，mg／g）

2．2 大鼠肺组织中Th17细胞的比例

N组大鼠肺组织中Th17的比例随时间变化无改变。P组大鼠肺组织内Th17的比例在第7天最高，此后逐渐下降。P、D组Th17的比例均高于N组（P＜0．05），D组Th17的比例低于P组，见表2。

表2 大鼠肺组织中的CD3＋CD8－IL－17＋Th17细胞百分率 （%）

2．3 大鼠肺组织中IL－21mRNA的表达

N组大鼠肺组织中IL－21的表达水平随时间变化无改变。P组大鼠肺组织中lL－21的表达水平在第7天最高，此后逐渐下降。P、D组IL－21的表达水平均高于 N组（P＜0．05），D组IL－21的表达水平低于P组（P＜0．05），见表3、图2。

表3 大鼠肺组织中IL－21的表达水平

图2 大鼠肺组织中IL－21的表达水平

3 讨论

本研究制造大鼠肺纤维化模型，采用当前在国际上广泛采用气管内注入BLM的实验方法［7］，因HYP含量能反映胶原代谢情况，故测定组织中HYP含量，可以判断纤维化程度［8］。本次研究结果发现：肺组织病变早期表现以肺泡的炎症反应为主，晚期表现以纤维化组织增生和细胞外基质沉积为主；实验模型组及药物干预组大鼠肺组织HYP含量的结果随时间逐渐升高，结果与文献［9，10］报道一致，提示本实验动物模型制备均成功。

为探讨Th17细胞及IL－21在肺纤维化中的表达及其意义，实验采用流式细胞术检测Th17细胞比率及RT－PCR半定量检测IL－21在博来霉素致大鼠肺纤维化模型中的动态表达。结果发现，P组肺组织中Th17细胞比率及IL－21的表达水平均高于N组（P＜0．05），尤其在第7天肺泡炎阶段Th17细胞及IL－21水平达高峰。P组肺组织中Th17细胞的比率高于N组与文献报道［11］相一致，但高峰提前。提示Th17细胞及IL－21可能与肺纤维化形成过程中的炎症损伤及纤维化形成关系密切。其可能机制：Th17细胞通过其分泌的IL－17来发挥强致炎作用［12］。IL－21形成自分泌环，诱导 Th17细胞分泌IL－21，IL－21促进CD4＋T分化为 Th17细胞［13］。IL－21直接激活NK细胞，经过JAK－STAT3信号通路，促进其细胞增殖和分化，从而发挥杀伤感染病毒细胞的作用，激活的NK细胞分泌细胞因子，细胞因子又能激活NK细胞，使其功能进一步增强，形成正反馈，同时单核－巨噬细胞被激活，其杀伤和吞噬病原菌的作用是通过ROIS和iNOS实现，因分泌大量细胞因子致炎症细胞聚集在感染部位，使炎症反应加强［14］。IL－21表达减少的小鼠，肺部炎症及纤维化减轻，表明IL－21促进肺部炎症和纤维化［15］。

本研究发现在应用糖皮质激素的D组，Th17细胞及IL－21水平的表达水平及变化趋势与P组相同，表达水平明显下降。可能的作用机制：糖皮质激素是一种强效免疫抑制剂，可以抑制多种细胞因子的合成与分泌［16］，降低免疫复合物水平和阻止多种有免疫效应的细胞功能，从而减少IPF的肺泡炎症和纤维化［17］。本研究提示：糖皮质激素可能通过抑制IL－21因子的表达从而减少Th17细胞的分泌的细胞因子，从而减轻炎症反应，抑制肺纤维化的进展。

本实验在动物水平研究关于Th17细胞及IL－21在肺纤维化中的作用和机制。实验动物与人类的发病机制基本相同但是还存在差异，应进一步行临床实验研究，为肺纤维化的治疗提供理论依据。

［1］杨梁梓，张济州，吕路艳，等．肺纤维化的研究进展［J］．云南中医中药杂志，2010，31（8）：74．

［2］Coward WR，Saini G，Jenkins G，et al．The pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Ther Adv Respir Dis，2010，4（6）：367．

［3］Raghu G，Collard HR，Egan JJ，et al．An Official ATS／ERS／JRS／ALAT Statement：idiopathic pulmonary fibrosis：evidencebased guidelines for diagnosis and management［J］．Am J Respir Crit Care Med，2011，183（6）：788．

［4］Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al．IL－17and Th17Cells Annu［J］．Rev immunol，2009，27：485．

［5］Hawing ton LE，M angan PR，W eaver CT，et al．Expanding the effector CD4＋T cell repertoire the Th17lineage CurrO pin［J］．immunol，2006，18（3）：349．

［6］Rosanne Spolski，Warren J．Leonard Interleukin－21：Basic biology and implications for cancer and autoimmunity［J］．Annu Rev Immunol，2008，26：57．

［7］Moriya Y，Sut；ihara K，Akasu T，et al．Importance of‘xtcndcd Lymph－adencdctomv woth lateral node dissection for advanced lower rectal cancer［J］．World J Surt，2004，21（9）：728．

［8］张 霞，欧阳学农，李晓冬，等．肠癌组织中TIP30基因的表达与转移预后间的关系及机制［J］．第一军医大学学报，2005，26（5）：488．

［9］Borensztajn K，Bresser P，van der Loos C，et al．Protease－activated receptor－2induces myofibroblast differentiation and tissue factor up－regulation during bleomycin－induced lung injury：potential role in pulmonary fibrosis［J］．Am J Pathol，2010，177（6）：2753．

［10］Gupte W，Ramasamy SK，Reddy R，et al．Overexpression of fibroblast growth factor－10during both inflammatory and fibrotic phases attenuates bleomycin－induced pulmonary fibrosis in mice［J］．Am J Respir Crit Care Med，2009，180（5）：424．

［11］董绍兴，邰文琳，王殿华，等．IL－17在博来霉素致小鼠肺纤维化形成中的表达［J］．西安交通大学学报，2012；33（2）：199．

［12］Happel KI，Zheng M，Younq E，et al．Cutting edge：roles of Toll－like receptor 4and IL－23in IL－17expression in response to Klebsiella pneumoniae infection［J］．J Immunol，2003，170（9）：4432．

［13］Korn T，Bettelli E，Gao W，et al．IL－21initiates an alternative paThway to induce proinflammatory Th17cells J［J］．J Nature，2007，448：484．

［14］Xu lin．Immunoregulatory Function of IL－21［J］．International Journal of Immunplogy，2006，29（6）：354．

［15］Pesce J，Kaviratne Aviratne M，Ramalingam T R，et al．TheIL－21receptor augments Th2effector function and alternative macrophage ac－tivation［J］．J Clin lnvest，2006，116（7）：2044．

［16］彭丽萍，左梦华，迟宝荣，等．甲基强地松龙治疗肺间质纤维化前后TNF－a和IL－8的变化［J］．吉林大学学报：医学版，2004，30（2）：286．

［17］Walter N，Collard HR，King TE Jr，et al．Current perspectives on the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis［J］．Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：330．