吉林省地区朝鲜族和汉族健康人群醛固酮合酶基因（CYP11B2）－344T／C多态性分布的研究

刘 行，隋明醒，王立平，汤 赢，全成实＊

（1．吉林大学病理生物学教育部重点实验室，吉林 长春130021；2．吉林大学白求恩医学院 临床医学2009级）

醛 固 酮 合 成 酶 （aldosterone synthase，CYP11B2）基因属于线粒体细胞色素P450酶超家族，是调节血压的一个重要基因［1］。CYP11B2基因主要有两种常见的变异，一种变异为CYP11B2基因的第2个内含子中大部分碱基被CYP11B1基因的序列所取代；另一种变异位于启动子区域－344位点处，该处是类固醇生成转录因子1（SF－1）的结合位点，该位点可发生C与T的交换［2］。研究表明，不同种族之间CYP11B2基因多态性的分布可能存在差异，而这种差异可能通过影响醛固酮的生成参与高血压及动脉粥样硬化等心血管疾病的进程［3］。因此，本研究检测和分析吉林省地区朝鲜族和汉族健康人群CYP11B2基因－344T／C位点的多态性分布，为原发性高血压等心血管疾病的前瞻性研究提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 研究对象

询问病史主要排除高血压病，糖尿病，心脑血管疾病和肿瘤等目前被证实与遗传有关的疾病。选取吉林省地区健康人群共126人，其中朝鲜族67人（男性33人，女性34人），汉族59人（男性28人，女性31人）。年龄35岁－79岁，平均年龄为55岁。受检者采外周静脉血2ml，－20℃保存备用。

1．2 基因组DNA提取

用淋巴细胞提取液（北京鼎国公司）从保存的血样中分离淋巴细胞，具体操作按说明书进行，常规方法提取基因组DNA。

1．3 PCR扩增CYP11B2基因的特异性片段

根据文献［4］设计引物，序列如下：P1：5＇－CAGGAGGAGACCCCATGTGAC－3＇，P2：5＇－CCTCCACCCTGTTCAGCCC－3＇。引物由上海生工合成，PCR产物片段为538bp。用TAKARA公司PCR试剂盒进行PCR反应。反应体系为20μl，其中上下游引物各位1．0mol·L－1，DNA模板为100ng，Tag DNA聚合酶混合物10μl。在PCR仪（PTC－100，MJ research．公司）上进行以下循环：94℃预变性5min，94℃变性50s，62℃退火50s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

1．4 酶切反应及电泳

酶切反应体系为20μl，其中PCR产物7μl，HaeⅢ内切酶（TAKARA公司）1μl，10×M buffer 2μl，灭菌水10μl，37℃水浴孵育30min。取酶切产物5μl于2．5%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外照射仪下观察结果。

1．5 CYP11B2基因多态性判定

PCR产物经HaeⅢ内切酶酶切后可观察到3种带型。具有273bp和137bp条带为纯合子TT基因型：203bp和137bp条带为纯合子TT基因型；同时含有273bp、203bp和137bp条带为杂合子TC基因型。

1．6 统计学处理

采用SPSS12．0进行数据统计分析。应用拟合优度χ2检验方法计算SNPs的基因频率分布是否符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律。两组之间的基因型频率以及等位基因频率分布的差异采用χ2检验。

2 结果

2．1 Hardy－Weinberg遗传平衡检验

经拟合优度χ2检验，CYP11B2基因型频率在朝鲜族和汉族健康人群组的分布符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律，P＞0．05，表明样本具有群体代表性。

2．2 CYP11B2基因多态性和等位基因分布比较

CYP11B2基因PCR扩增产物为538bp，见图1。PCR产物经HaeⅢ内切酶酶切后可观察到3种带型。具有203bp和137bp条带为纯合子CC基因型；273bp和137bp条带为纯合子TT基因型；同时含有273bp，203bp和137bp条带的为杂合子TC基因型，见图2。

67名朝鲜族中CC、TC和TT基因型频率分别为9%（6／67）、22%（15／67）和69%（46／67）；59名汉族中CC、TC和TT基因型频率分别为19%（11／59）、27%（16／59）和54%（32／59），两者差异无显著性（χ2＝3．522；P＝0．172），见表1。

朝鲜族人群中C和T等位基因频率分别为20%和80%；汉族人群中分别为32%和68%，两者差异具有显著性（χ2＝4．763；P＝0．029），见表1。

图1 CYP11B2基因PCR产物电泳图

图2 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图

表1 朝鲜族和汉族CYP11B2基因型和等位基因频率分布（%）

3 讨论

醛固酮合成酶（aldosterone synthase，CYP11B2）基因是醛固酮体内生物合成的关键基因，位于8号染色体长臂远端，含有9个外显子和8个内含子［5］。CYP11B2基因转录调控区和第2内含子区域有两个位点存在基因多态性现象，即－344T／C和－470T／C，其中－344T／C位点的基因多态性与原发性高血压病的关系引起人们的关注［6］。CYP11B2基因具有合成醛固酮的作用，通过调节水钠代谢影响血压。因此，CYP11B2基因已被确认为是原发性高血压的主要候选基因之一。

有研究表明，延边地区朝鲜族成人高血压患病率明显高于当地汉族［7］。有关膳食结构、生活习惯及环境因素与朝鲜族和汉族成人高血压患病率的关系已有研究报道［8］，但有关吉林省地区朝鲜族和汉族人群的高血压患病率与相关基因易感性的研究尚未见报道。CYP11B2基因多态性及等位基因分布频率存在种族差异，这种差异对原发性高血压等心血管疾病具有一定的预测价值。本研究检测和分析了吉林省地区朝鲜族和汉族健康人群CYP11B2基因－344T／C多态性及其分布特征。结果显示，67名朝鲜族人群中CC、TC和TT基因型分别为6例、15例和46例；59名汉族人群中CC、TC和TT基因型分别为11例、16例和32例，两者差异无显著性。结果提示，朝鲜族和汉族原发性高血压的易感性可能与CYP11B2基因－344T／C多态性没有明显的关系，朝鲜族心脑血管疾病的死亡率明显高于当地汉族，可能与饮食和环境等生活方式有关。本实验结果同时显示，朝鲜族C和T等位基因频率分别为20%和80%；汉族分别为32%和68%，两者差异具有显著性。中国吉林省地区朝鲜族健康人群CYP11B2基因－344T／C多态性C等位基因频率低于当地汉 族，明 显 低 于 日 本［9］（35．9%）、法 国［10］（46%）及芬兰［11］（52．6%），进一步提示 CYP11B2基因C和T等位基因分布具有种族差异。

本研究初步研究中国吉林省地区朝鲜族和汉族健康人群CYP11B2基因－344T／C多态性分布的特点。由于人群分布的局限性及样本量少，不一定能够代表中国朝鲜族和汉族人群CYP11B2基因－344T／C多态性的分布状况，有待于进一步在中国多个地区扩大样本量。在不常人群中获得基因多态性分布的相关资料，将有助于对相关疾病进行遗传学及前瞻性研究。

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