太白楤木总皂苷对肝纤维化大鼠Smads4基因表达的影响

崔大江 杨渭临 李秀丽

西安交通大学医学院第二附属医院老年医学科 (陕西西安，710004)

本研究旨在观察太白楤木总皂苷对四氯化碳 (CCl4)诱导的肝纤维化大鼠肝脏胶原沉积的影响，了解其对大鼠肝脏Smads4基因表达的影响，进一步从分子水平探讨太白楤木总皂苷干预实验性大鼠肝纤维化的可能分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料 化学纯CCl4［批号20000923，上海华东试剂公司产品］，太白楤木总皂苷 (由本院药剂科提供);大鼠Smads4 mRNA探针及原位杂交试剂盒 (上海申能生物工程公司);大鼠Smads4蛋白SABC免疫组化试剂盒 (英国abcam公司生产)，BCIP/NBT为北京中山生物技术有限公司产品;TGFβ1-ELISA试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司);其余试剂为分析纯。

1.2 动物与分组 体质量 (150±10)g健康SD雄性大鼠80只 (购自西安交通大学医学院实验动物中心)，随机分为3组:对照组20只，肝纤维化组 (简称模型组)30只，用CCl4皮下注射 (SC)法造模 (化学纯CCl4配制成300ml/L浓度的石蜡油溶液，SC剂量3ml/kg，2次/wk×8wk)，太白楤木总皂苷组 (简称治疗组)30只，造模同时给予太白楤木总皂苷灭菌水溶液 (浓度100g/L，剂量5mg/kg，2次/wk×8wk)ip，大鼠肝组织以40g/L中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，以多聚赖氨酸涂布的载玻片制作切片。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠血清TGFβ1检测 参照试剂说明书采用ELISA法分别加入待测血清，二抗，显色剂，反应后用酶标仪读数测定血清TGFβ1含量。

1.3.2 肝组织病理学检测 肝组织切片HE染色，Masson胶原染色作组织病理学检查，显微镜下观察，以计算机图像分析系统进行胶原含量定量分析。

1.3.3 大鼠肝组织Smads4蛋白表达免疫组化检测 切片常规脱蜡至水，经微波修复抗原，抗Smads4多克隆抗体稀释度为1∶100，以PBS代替一抗作阴性对照;切片依次加一抗、生物素化二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察，随机选取每张切片10个视野 (×200倍)测定阳性细胞的所占视野细胞的比例，以计算机图像分析系统进行Smads4蛋白表达水平定量分析。

1.3.4 大鼠肝组织Smads4 mRNA表达原位杂交检测Smads4探针浓度为5μmol/L，切片常规脱蜡至水，经复合酶消化，预杂交，杂交，封闭等步骤，NBT/BCIP显色，核固红复染，中性树胶封片，显微镜下观察，随机选取每张切片10个视野 (×200倍)，测定阳性细胞所占的比例，以计算机图像分析系统进行mRNA表达水平定量分析。

2 结果

2.1 太白楤木总皂苷对大鼠血清TGFβ1水平的影响 见表1。

表1 各组大鼠血清TGFβ1水平及肝组织胶原面积比例比较(x¯±s)

2.2 太白楤木总皂苷对大鼠肝组织病理学改变的影响 见表1。模型组大鼠肝脏呈黄褐色，表面布满细小结节，HE染色可见肝细胞广泛变性、坏死，以中央静脉周围为重;Masson染色见正常 (对照组)肝脏胶原纤维含量稀少 (平均每个视野约占肝组织总面积的0.011)，模型组大鼠肝脏胶原纤维显著增生，汇管区－中央静脉区纤维间隔宽大，胶原纤维显著增生并包绕分隔肝小叶，部分已形成假小叶。

2.3 太白楤木总皂苷对大鼠肝组织Smads4表达的影响 见表2。免疫组化染色可见，正常大鼠肝组织未检出明显的Smads4表达，模型组大鼠肝组织则Smads4表达明显增加，棕黄色阳性颗粒定位于细胞质和细胞核，阳性细胞集中于汇管区，以梭状的间质细胞为主，肝细胞未见明确阳性反应;太白楤木总皂苷干预组大鼠肝组织Smads4表达较模型组明显减少，阳性细胞亦主要位于汇管区，以间质细胞为主。原位杂交检测正常肝组织未见明显Smads4 mRNA阳性表达细胞;模型组大鼠肝组织有大量Smads4 mRNA阳性细胞，肝实质细胞与间质细胞均有表达，蓝紫色阳性颗粒主要定位于细胞质。

表2 各组大鼠肝组织Smads4表达阳性率比较(±s)

表2 各组大鼠肝组织Smads4表达阳性率比较(±s)

与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 n Smads4蛋白Smads4 mRNA对照组 20 0△△ 0△△模型组 30 0.135±0.086 0.723±0.090治疗组 30 0.024±0.007△ 0.229±0.019△

3 讨论

多项研究表明，TGFβ1-Smad信号通路是肝纤维化时主要的信号转导通路［1］，Smads是一族传递TGFβ信号的分子，Smads4则为传递信息必须的共用Samds分子，阻断或干扰该信号转导通路有可能阻止肝纤维化进程［2］，为肝纤维化的治疗带来了新希望。目前已从化学药物、细胞因子、基因调控等方面对抗肝纤维化进行了广泛的探索，结果不尽如意。我国学者在对中草药的研究中发现，不少中药在控制肝纤维化方面具有一定的疗效，显示了良好的发展前景［3］。这些药物价格低廉，副作用小，易于为患者所接受，但多数中药疗效研究仅限于动物实验或简单临床观察，缺乏系统的分子水平研究。太白楤木总皂苷是太白楤木的主要成份，研究表明［3～5］，太白楤木总皂苷具有一定的抗乙肝病毒、抑制肝星状细胞核因子κB活性及抗肝纤维化的作用。

本研究结果表明:CCl4诱导的大鼠肝纤维化出现Smads4表达明显增加，反映肝纤维化病变的进展;太白楤木总皂苷水溶液能够有效地减轻CCl4诱导的肝组织损害和肝脏胶原沉积，降低大鼠血清TGFβ1水平，Smads4蛋白及Smads4 mRNA表达阳性率均下降，太白楤木总皂苷减弱Smads4基因的表达，有效地干预了TGFβ介导的肝纤维化信号转导过程，这可能是其抗肝纤维化分子机制之一。

［1］ GRESSNER AM，WEISKIRCHEN R，BREITKOPF K，et al.Roles of TGF-beta in hepatic Fibrosis ［J］ .Front Biosci，2002，152(2):793－807.

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［3］崔大江，杨渭临，李秀丽.太白楤木总皂苷对HBV DNA的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2011，21(4):216－218.

［4］崔大江，聂丹丽，衣蕾.太白楤木对大鼠肝星状细胞核因子-κB活性表达的影响 ［J］.辽宁中医药大学学报，2010，12(4):48－49.

［5］崔大江，杨渭临，李秀丽.太白楤木总皂苷体外对乙肝病毒HB-sAg、HbeAg的影响［J］.同济大学学报 (医学版)，2012，33(2):47－49.