雄激素受体基因c.528C＞A变异与雄激素不敏感综合征无关＊

李 华，马明义，杜 亭，雷 娟，覃 维，张宇翔

（1.泸州医学院附属医院内分泌科，四川泸州 646000；2.泸州医学院医学细胞生物学与遗传学教研室，四川泸州 646000；3.泸州医学院临床医学系，四川泸州 646000）

雄激素对男性个体发生、生长发育和生殖功能等都起着十分重要的作用。雄激素必须通过靶器官上特异的雄激素受体（androgen receptor，AR）而起作用。雄激素不敏感综合征（androgen insensitivity syndrome，AIS）是由于AR基因缺失、突变导致AR功能障碍或缺失引起雄激素的作用减弱或消失。遗传方式为X-连锁隐性遗传，发病率为出生男婴的1／64 000～1／20 000［1］。本研究通过对一AIS个体家系成员AR基因突变的检测，探讨AIS发病的分子病因。

1 资料与方法

1.1 病例 患者，28岁，因男性发育不足，无腋毛，阴茎短小、阴毛稀疏来泸州医学院附属医院内分泌科求诊。性激素检查：睾酮（T）升高41.32mmol／L，卵泡刺激素（FSH）87.45IU／L，雌二醇（E2）106.43pmol／L，促黄体素（LH）升高24.75IU／L；细胞遗传学检查核型为：46，XY，临床诊断该患者为AIS。签署知情同意书后，患者及其父母静脉各抽血5mL供研究。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因组DNA的提取 患者及其家系成员、150名健康男性外周血基因组的DNA采用天根生化科技有限公司试剂盒提取，操作按说明书进行。

1.2.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增根据GenBank中AR基因序列（NM 000044.3），用Primer 5.0软件设计引物，对AR基因的全部8个外显子及外显子和内含子交界区分别进行扩增，PCR扩增产物送测序。引物合成和测序均由上海Invitrogen公司完成。外显子1扩增片段为2 100bp，除用正向和反向引物测序外，还设计了两条测序引物，以期把该片段测通。引物序列、退火温度、扩增片段的大小及测序引物序列见表1。扩增条件及参数：PCR反应体系为50μL，其中dNTP 10pmol／L，MgCl21.5mmol／L，0.2μg基因组DNA，引物10pmol，TaKaRa Taq酶2U。PCR扩增反应在PTC-200型热循环仪（MJ Research）上进行，扩增参数：冷启动，94℃预变性5min，94℃变性30s，55～59℃复性30s，72℃延伸30s至2min，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙啶染色，Gel Doc1000凝胶成像分析系统观察并保存电泳结果。

1.2.3 AR基因外显子1c.528C＞A变异在健康男性中的检测 c.528C＞A变异导致了该处限制性核酸内切酶AluI酶切位点的消失，用Primer 5.0软件设计一对引物，F：5′-AGC TGC CCC ATC CAC GTT GTC C-3′；R：5′-GGA AGT GGG AGC CCC CGA GG-3′，扩增片段为187bp，内切酶AluI购置于NEB，酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙啶染色，Gel Doc1000凝胶成像分析系统观察并保存电泳结果。酶切后野生型片段为：133bp＋54bp；突变型为：187bp。

表1 雄激素受体基因各外显子及c.528C＞A位点PCR扩增条件和测序引物

续表1 雄激素受体基因各外显子及c.528C＞A位点PCR扩增条件和测序引物

2 结 果

AR基因8个外显子PCR扩增的电泳结果，见图1。c.528C＞A位点突变型和野生型男性AluI酶切后电泳结果，见图2。c.528C＞A位点突变型和野生型男性测序结果，见图3。

图1 AR基因8个外显子PCR扩增的电泳结果

图2 c.528C＞A位点突变型和野生型男性AluI酶切后电泳结果

图3 c.528C＞A位点突变型和野生型男性测序结果

3 讨 论

AR基因是一单拷贝的X染色体基因。AIS可分为完全型雄激素不敏感综合征（complete androgen insensitivity syndrome，CAIS）和部分型雄激素不敏感综合征（partial androgen insensitivity syndrome，PAIS）。CAIS的临床表现较为特异，诊断和鉴别较为容易。PAIS的临床诊断和鉴别较为困难，容易与其他病因所致的男性性发育异常混淆。在AR基因克隆之前，测定外阴皮肤成纤维细胞对雄激素的结合力一直作为诊断AIS的金标准，但随后的研究发现了AR结合力正常的AIS［2-3］，因此AR基因的分子检测是诊断PAIS患者较为准确的方法。迄今，人类基因组突变数据库收录了AIS患者AR基因的343条突变。AR基因外显子2～8是AIS的突变“热区”［4］。目前国内文献对AR基因突变的筛查仅筛查外显子2～8［5-6］，虽外显子1的突变较罕见，但也有外显子1突变导致AIS的病例报道［7-9］。

本研究发现一PAIS患者外显子1存在c.528C＞A变异，该变异由他母亲传递而来，查阅相关生物信息学数据库证实该变异还未见报道。c.528C＞A变异虽未导致氨基酸的改变，但由于近年来的研究表明该类变异有可能影响mRNA的稳定性和外显子的剪接［10］，因患者拒绝提供外阴皮肤成纤维细胞，为评估该变异是否是AIS的致病病因，作者用限制性片段长度多态分析法对150名健康男性AR基因c.528C＞A变异进行检测，结果发现该变异在健康男性中也存在，频率很低（3／150），所以该变异并不是该患者致病的病因，该患者致病位点的探寻还有待于进一步研究。

目前报道的AIS患者的突变多位于外显子上，但基因诊断中常发现有相当数量的PAIS患者全部外显子检测均未见异常，这些患者发病的病因很有可能是内含子深处的变异导致AR基因mRNA的错误剪接或剪接效率改变所致，但相关的研究获得病人外阴皮肤成纤维细胞是关键。每一条新的AR基因功能性变异的发现都将丰富AR基因的突变谱，为诊断和预防AIS患者的出生提供理论依据和可能。

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