结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突变株的构建与鉴定

田玺择，吴 芳，章 乐，曹旭东，张万江

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的世界性传染病，我国的结核病疫情依然十分严重，肺结核病的发病和死亡人数始终排在法定报告传染病的首位。结核分枝杆菌感染人体后主要寄生在宿主巨噬细胞内，结核分枝杆菌小分子热休克蛋白 （small heat shock proteins，sHSPs）Hsp16．3是其在宿主巨噬细胞内生存繁殖所必需的蛋白质［1－2］，虽然有研究表明 Hsp16．3对于结核分枝杆菌的潜伏感染具有非常重要的作用［3－4］，然而目前对 Hsp16．3基因（hspX，Rv2031C）的功能仍知之甚少。本研究利用基因敲除技术构建了结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突变株，为进一步研究Hsp16．3基因的功能及探讨结核病的防治提供可行的研究方法。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌种和质粒 结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株、大肠杆菌DH5α由本室保存，pKO质粒由美国 Washington university的Sherman DR教授惠赠，pMD19－T载体购于Takara公司。

1．1．2 试剂及材料 限制性内切酶 KpnI、BamHI、PstI、HindIII、T4DNA 连接酶（Fermentas公司），Taq酶（Takara公司），质粒抽提试剂盒、产物纯化试剂盒、切胶回收试剂盒（上海生工生物工程公司）。潮霉素（hygromycin）购于Roch公司，卡那霉素（kanamycin）购于Solarbio公司，油酸（oleicacid）、白蛋白（albumin）、葡萄糖（dextrose）和过氧化氢酶（catalase）的复合组分（英文缩写为OADC）购自Difco公司，电转仪购于Eppendorf公司。

1．2 方法

1．2．1 结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株基因组DNA的提取与纯化 将结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv接种到Sauton液体培养基中，37℃静置培养3～4周后收集菌体，基因组DNA的具体提取方法见参考文献［5］。

1．2．2 引物设计及目的基因的PCR扩增 根据GenBank中Hsp16．3基因的全序列，并结合结核分枝杆菌H37Rv国际标准株全基因组序列自行设计引物：

引 物 P1：5′－TTAGGTACCCACCGTGGTCCGAGATT－3′（KpnI），

引物P2：5′－ATAGGATCCCCCGTGTACGTGCTGAAT－3′（BamHI），

引物P3：5′－TTACTGCAGGGATAGCCGAGGACCACA－3′（PstI），

引 物 P4：5′－TTAAAGCGGGCAATACGGCGGAAAGC－3′（HindIII）。

引物 P4：5′－CGCGGATCCATGGCCACCACCCTTC－3′

引 物 P6：5′－CCCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGG－3′

引物由北京六合华大基因公司合成。序列中下划线部分表示引入的酶切位点，引物P1与P2分别引入KpnI和BamHI的酶切位点，引物P1与P2扩增产物为 Hsp16．3基因5′端侧翼序列5′－Hsp 16．3，PCR 产 物 长 度663bp，PCR 反 应 条 件 为：94℃预变性5min；94℃变性50s，57．9℃退火1 min，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸5 min；引物P3与P4分别引入PstI和HindIII的酶切位点，引物P3与P4扩增产物为Hsp16．3基因3′端侧翼序列3′－Hsp16．3，PCR 产物长度684bp，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸5min；引物P5与P6扩增产物为Hsp16．3基因，PCR产物长度435bp，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸50s，共30个循环，72℃延伸5min。扩增后对PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析。

1．2．3 目的基因的克隆及鉴定 按照Molecular cloning：a laboratory manual［6］方法，将 PCR 扩增出的5′－Hsp16．3和3′－Hsp16．3用 PCR 产物纯化试剂盒纯化后，分别与pMD19－T载体连接，连接产物分别转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含100μg／mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，取单菌落进行菌液PCR筛选，抽提质粒并进行质粒PCR及双酶切鉴定，阳性克隆送北京六合华大基因公司测序。

1．2．4 基因打靶载体的构建 将pKO质粒DNA和 T－5′－Hsp16．3分别用限制性内切酶 KpnI和BamHI于37℃双酶切3h，双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，分别切胶回收纯化。纯化后的线形质粒DNA与5′－Hsp16．3用T4DNA连接酶22℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后筛选并鉴定。将得到的阳性重组质粒DNA与T－3′－Hsp16．3分别用限制性内切酶PstI和HindIII于37℃双酶切3h，双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收纯化，将纯化后得到的线形质粒DNA与3′－Hsp16．3用T4DNA连接酶22℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含50μg／mL卡那霉素的LB平板，37℃恒温箱中倒置培养16h，挑取单菌落做菌液PCR筛选，将阳性克隆接种于含50μg／mL卡那霉素的LB液体培养基中摇菌过夜，次日抽提重组质粒，将该重组质粒命名为pKO－Hsp16．3，构建示意图见图1。

1．2．5 基因打靶载体的PCR鉴定、双酶切鉴定及测序 以构建出的pKO－Hsp16．3重组质粒DNA为模板，分别以P1、P2和P3、P4为引物扩增两个目的片段，扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。将构建出的pKO－Hsp16．3重组质粒分别用限制性内切酶KpnI、BamHI和PstI、HindIII于37℃双酶切3h，双酶切后，对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。并将pKO－Hsp16．3重组质粒送北京六合华大基因公司测序。

图1 结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因打靶载体的构建示意图Fig．1 Construction of targeting vector for gene encoding Hsp16．3of Mycobacterium tuberculosis H37Rv

1．2．6 结核分枝杆菌H37Rv菌株感受态细胞的制备及电转化 结核分枝杆菌H37Rv接种于含有100mL Sauton培养液的锥形瓶中，200r／min摇床37℃培养。将摇床培养约2周的结核分枝杆菌H37Rv菌株冰浴1h后，4 000r／min离心10min收集菌体。弃上清后，重悬于10%的预冷甘油中4 000r／min离心10min，重复洗涤3次，用10%的预冷甘油重悬菌体后用于电转化。取100μL菌液加入纯化后的pKO－Hsp16．3重组质粒4μg后转入0．1cm的电极杯中，在18×105V／m，25μF，1 000Ω条件下电转化，电转后用1mL含10%OADC的Sauton培养液稀释并转移到10mL试管中，37℃复苏20h，取300μL涂布于含10%OADC及30 μg／mL卡那霉素的Sauton固体培养基平板上，37℃倒置培养3～4周至单个菌落形成。

1．2．7 Hsp16．3基因缺失突变株的筛选及鉴定从Sauton固体培养基平板上挑取菌落接种至5mL含10%OADC及30μg／mL卡那霉素的Sauton培养液中，37℃静置培养2～3周，待菌膜生长超过50%后，挑菌并加入l×三羟甲基氨甲烷－乙二胺四乙酸（Tris－EDTA．TE）15μL重悬菌体，煮沸10 min，4 000r／min离心2min，取上清2μL为模板，以引物P1和P4进行PCR扩增，反应条件同前。扩增后进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，标记只扩增出2 600bp左右的DNA片段的菌株。取作标记的菌株的菌液，分别接种于含有10%OADC和10%蔗糖 （sucrose）的Sauton液体培养基中，37℃培养2～3周，可挑菌并加入TE 15μL重悬菌体，煮沸10min，4 000r／min离心2min，取上清2μL为模板，以引物P1和P4进行PCR扩增，反应条件同上，扩增后进行1% 琼脂糖凝胶电泳分析。将仅扩增出2 600bp左右的DNA片段的菌株作标记，取作标记的菌株的菌液，以P5和P6为引物，以未作电穿孔的H37Rv菌株为对照进行PCR扩增，反应条件同前。同时取作标记的菌株的菌液，接种到5 mL含10%OADC和50μg／mL潮霉素的Sauton培养液中，37℃培养2～3周，观察其生长。

2 结 果

2．1 目的基因PCR扩增的检测 以结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株全基因组DNA序列为模板，分别以引物P1、P2和引物P3、P4扩增两个目的片段5′－Hsp16．3和3′－Hsp16．3，琼脂糖凝胶电泳检测显示663bp和684bp的两条特异性扩增条带，符合预期大小。

2．2 pKO－Hsp16．3基因打靶载体的PCR、双酶切鉴定及测序结果 以pKO－Hsp16．3质粒DNA为模板，分别以引物P1、P2和P3、P4扩增两个目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测显示663bp和684bp的两条特异性扩增条带，同预期结果相一致（图2），重组质粒pKO－Hsp16．3分别经KpnI、BamHI和PstI、HindIII双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，获得663bp和684bp的两条特异性条带，与预期结果相符（图3）。并将该重组质粒pKO－Hsp16．3送北京六合华大基因公司测序，证实两个目的片段5′－Hsp16．3和3′－Hsp16．3已插入到预定位点，说明已成功构建出结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因打靶载体。

图2 pKO－Hsp16．3重组质粒的质粒PCR鉴定Fig．2 PCR identification of pKO－Hsp16．3vectorM：Marker DL2000；1：PCR product of primer 1 and primer 2；2：PCR product of primer 3and primer 4．

图3 pKO－Hsp16．3重组质粒的双酶切电泳分析Fig．3 Restriction analysis of pKO－Hsp16．3vector 1：pKO－Hsp16．3／（Kpn Ⅰ＋BamH Ⅲ）；2：pKOHsp16．3／（Pst Ⅰ ＋ Hind Ⅲ ）； M1： Marker DL15000

图4 结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突变株的菌落PCR鉴定Fig．4 PCR identification of H37Rv strain with Hsp16．3gene deleted mutantM：Marker DS15000；1：Negative control；2－3：Different H37Rv strains with Hsp16．3gene deleted mutant identified by PCR．

2．3 pKO－Hsp16．3基因缺失突变株的筛选与鉴定基于pKO质粒自身的特点，在筛选时采用PCR的方法，在卡那霉素筛选后，进行蔗糖的反筛选，由于带有蔗糖基因的菌株不能够在含有蔗糖的培养基中生长，因此将含有10%蔗糖的Sauton培养基上的菌落做PCR鉴定，仅扩增出了长度为2 600bp左右DNA片段（图4）。将这些菌落以P5和P6为引物做PCR鉴定（图5），均未能扩增出435bp左右的片段，并且在含潮霉素的培养基中不能生长的菌株即为Hsp16．3基因缺失突变株。

图5 结核分枝杆菌Hsp16．3基因缺失突变株的电泳分析Fig．5 Electrophoresis of MTB strains with Hsp16．3gene deleted mutantM：Marker DL2000；1：H37Rv strain identified by PCR；2－3：H37Rv strains with Hsp16．3gene deleted mutant identified by PCR．

3 讨 论

全球约有1／3人口被结核分枝杆菌潜伏感染［7］，该人群在免疫力下降，尤其是免疫系统受到损害时会发展成为结核病。结核分枝杆菌在低氧或缺氧状态时会大量合成 Hsp16．3［8－11］，当结核分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞后期，Hsp16．3的表达量则会更多，T细胞可以特异性的识别Hsp16．3蛋白，并将其从被感染的巨噬细胞中分离出来，这种反应在结核分枝杆菌潜伏期更为明显［12－14］，说明 Hsp16．3蛋白在结核分枝杆菌潜伏性感染阶段扮演着重要角色。宿主对结核分枝杆菌等细胞内寄生菌的防御主要依赖于有效的细胞免疫，其机制为被感染的巨噬细胞被细胞免疫因子所活化，尤其是由自然杀伤细胞和抗原特异性T细胞产生的γ干扰素。Hsp16．3抗原能够部分活化结核菌素纯蛋白衍生物 （PPD）试验阳性机体的外周血单核细胞和CD＋4T淋巴细胞，诱导Thl型细胞免疫反应，并分泌干扰素，有效清除结核分枝杆菌［1］；同时CD＋8T淋巴细胞可以识别Hsp16．3的多肽表位，活化的CD＋8T淋巴细胞可以诱导产生γ干扰素和α干扰素，从而通过粒细胞溶解素和表位穿孔素溶解被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞，因此，对Hsp16．3蛋白的研究可以为结核新型疫苗的研究提供有力依据［15］，尤其是对潜伏感染者可能起到有效预防作用［16］。另有研究发现，结核分枝杆菌进入宿主巨噬细胞后，既可以诱导合成大量的 Hsp16．3蛋白［16］，又可通过调控宿主巨噬细胞的凋亡来逃避宿主巨噬细胞的杀伤，进而在宿主巨噬细胞内长期生长繁殖和致病。然而Hsp 16．3蛋白在结核分枝杆菌与宿主巨噬细胞相互作用中的作用机理尚不清楚。因此为了深入探讨结核病的发病机制，对于Hsp16．3基因功能的研究已十分必要。

基因打靶技术是一种理想的修饰改造生物遗传物质的新兴技术，是研究目的基因功能的有效方法。基因打靶技术的关键是打靶载体的构建，pKO质粒可以在大肠杆菌中进行复制，而在结核分枝杆菌中不能自主扩增，并且pKO质粒具有正选择标记基因Kan（卡那基因）和负选择标记基因sacB（蔗糖基因），在进行基因缺失突变株的筛选时，由于含有sacB蔗糖负选择标记基因，在含有蔗糖的培养基中带有sacB基因的菌体将不能存活，故无需再用Southern blotting技术进行进一步鉴定，因此pKO质粒被认为是结核分枝杆菌中进行基因敲除的良好载体［17］。本研究通过扩增结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因两侧Rv2030c基因和acg基因中分别为663bp和684bp的两个DNA片段，并插入到pKO质粒的两个预定位点，得到了结核分枝杆菌H37Rv菌株Hsp16．3基因打靶载体，并将该打靶载体电转入结核分枝杆菌H37Rv菌株中进行同源重组，成功构建出了结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16．3基因缺失突变株。为进一步研究Hsp16．3基因的功能及探讨结核病的防治与新型结核疫苗的研究提供可行的研究方法。

［1］Fu X，Chang Z．Temperature－dependent subunit exchange and chaperone－like activities of Hsp16．3，a small heat shock protein from Mycobacterium tuberculosis［J］．Biochem Biophys Res Commun，2004，316（2）：291－299．DOI：10．1016／j．bbrc．2004．02．053

［2］Fu X，Liu C，Liu Y，etal．Small heat shock protein Hsp16．3 modulates its chaperone activity by adjusting the rate of oligomeric dissociation［J］．Biochem Biophys Res Commun，2003，310（2）：412－420．DOI：10．1016／j．bbrc．2003．09．027

［3］Li Q，Yu H，Zhang Y，etal．Immunogenicity and protective efficacy of a fusion protein vaccine consisting of antigen Ag85Band HspX against Mycobacterium tuberculosis infection in mice［J］．Scand J Immunol，2011，73（6）：568－576．DOI：10．1111／j．1365－3083．2011．02531．x

［4］Rabahi MF，Junqueira－Kipnis AP，Dos Reis MC，etal．Humoral response to HspX and GlcB to previous and recent infection by Mycobacterium tuberculosis［J］．BMC Infect Dis，2007，7：148．DOI：10．1186／1471－2334－7－148

［5］Zhang ZQ，Ishaque M．Evaluation of methods for isolation of DNA from slowly and rapidly growing Mycobacteria［J］．Int J Lepr Other Mycobact Dis，1997，65（4）：469－476．

［6］Sambrook J，Russell DW．Molecular cloning：a laboratory manual［M］．New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001：21．

［7］Roupie V，Romano M，Zhang L，etal．Immunogenicity of eight dormancy regulon－encoded proteins of Mycobacterium tuberculosis in DNA－vaccinated and tuberculosis－infected mice［J］．Infect Immun，2007，75（2）：941－949．DOI：10．1128／IAI．01137－06

［8］Saha A，Sharma A，Dhar A，etal．Antagonists of Hsp16．3，a low－molecular－weight mycobacterial chaperone and virulence factor，derived from phage－displayed peptide libraries［J］．Appl Environ Microbiol，2005，71（11）：7334－7344．DOI：10．1128／AEM．71．11．7334－7344．2005

［9］Liang J，Zeng F，Guo A，etal．Microarray analysis of the chelerythrine－induced transcriptome of Mycobacterium tuberculosis［J］．Curr Microbiol，2011，62（4）：1200－1208．DOI：10．1007／s00284－010－9837－5

［10］Starck J，Kallenius G，Marklund BI，etal．Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis grown under aerobic and anaerobic conditions［J］．Microbiology，2004，150（Pt 11）：3821－3829．DOI：10．1099／mic．0．27284－0

［11］Dahl JL，Arora K，Boshoff HI，etal．The relA homolog of Mycobacterium smegmatis affects cell appearance，viability，and gene expression［J］．J Bacteriol，2005，187（7）：2439－2447．DOI：10．1128／JB．187．7．2439－2447．2005

［12］Spratt JM，Britton WJ，Triccas JA．In vivo persistence and protective efficacy of the bacille Calmette Guerin vaccine overexpressing the HspX latency antigen［J］．Bioeng Bugs，2010，1（1）：61－65．DOI：10．4161／bbug．1．1．10027

［13］Kong CU，Ng LG，Nambiar JK，etal．Targeted induction of antigen expression within dendritic cells modulates antigen－specific immunity afforded by recombinant BCG［J］．Vaccine，2011，29（7）：1374－1381．DOI：10．1016／j．vaccine．2010．12．070

［14］Jeon BY，Kim SC，Eum SY，etal．The immunity and protective effects of antigen 85Aand heat－shock protein X against progressive tuberculosis［J］．Microbes Infect，2011，13（3）：284－290．DOI：10．1016／j．micinf．2010．11．002

［15］Caccamo N，Meraviglia S，La Mendola C，etal．Characterization of HLA－DR－and TCR－binding residues of an immunodominant and genetically permissive peptide of the 16－kDa protein of Mycobacterium tuberculosis［J］．Eur J Immunol，2004，34（8）：2220－2229．DOI：10．1002／eji．200425090

［16］Demissie A，Leyten EM，Abebe M，etal．Recognition of stagespecific mycobacterial antigens differentiates between acute and latent infections with Mycobacterium tuberculosis［J］．Clin Vaccine Immunol，2006，13（2）：179－186．DOI：10．1128／CVI．13．2．179－186．2006

［17］Kao TM，Hsieh SM，Kung HC，etal．Immune response of single dose vaccination against 2009pandemic influenza A （H1N1）in the Taiwanese elderly［J］．Vaccine，2010，28：6159－6163．DOI：10．1016／j．vaccine．2010．07．026