幽门螺杆菌ureI核酸疫苗免疫活性的初步研究

李 杰，于 文，刘 胜，张 艳，朱翠明，吴移谋

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori）是一种寄居于人体消化道，并可引起胃炎、消化性溃疡、胃腺癌以及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的病原体［1－4］。目前临床治疗 H．pylori感染主要采用质子泵抑制剂和两种抗生素的三联疗法，但缺点是容易引起耐药株的产生从而导致治疗失败。研究高效的H．pylori疫苗，不但能通过诱发特异性免疫应答而清除病原体，同时也能诱导相应的免疫记忆来防止H．pylori再感染。在众多的候选抗原中，尿素通道基因（ureI）是H．pylori的管家基因，几乎分布于H．pylori所有亚型当中，在H．pylori于酸环境中的存活、定植上起关键作用。UreI蛋白高度保守，不同菌株的UreI蛋白之间同源性非常高［5－6］。Mollenhauer等［7］发现，抑制 UreI的活性则有利于胃内H．pylori的清除。本研究选用本课题组前期构建并鉴定无误的ureI核酸疫苗［8］，分析其免疫小鼠后体液免疫及细胞免疫水平，为进一步研究该疫苗的免疫保护作用及新的H．pylori核酸疫苗的研制提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 动物和载体 C57BL／6雌性小鼠，6周龄，体重17～20g，由上海斯莱克实验动物中心提供；E．coli JM109、E．coli BL21、pcDNA3．1（＋）以及pcDNA3．1（＋）／ureI真核表达载体为本实验室前期所构建［8］。

1．2 试剂 蛋白纯化试剂盒购自Merk；BCA蛋白浓度测定试剂盒为碧云天生物技术研究所产品；IFN－γ、IL－4ELISA试剂盒为美国eBioscience公司产品；兔抗H．pylori多克隆抗体购自Abcam；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗为北京康为世纪生物科技有限公司产品；MTT为南京建成生物工程研究所产品。

1．3 免疫接种 30只雌性C57BL／6小鼠随机分为3 组：PBS 组、pcDNA3．1（＋）组、pcDNA3．1（＋）／ureI组，每组10只。将空质粒和重组质粒分别用无菌PBS稀释至1g／L，100μL接种于小鼠左后腿股四头肌，每2周免疫1次，共免疫4次。

1．4 抗体滴度测定 初次免疫当天及其后的第2、4、6、8和10周分别采取小鼠断尾采血，分离血清，间接ELISA法检测抗体滴度：用重组的UreI蛋白包被96孔酶标板，不同浓度倍比稀释的免疫小鼠血清为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗。酶标仪读取450nm波长吸光度值，实验组和阴性对照组吸光度比值≥2．0时最大的血清稀释倍数为其抗体滴度［9］。

1．5 细胞因子检测 获取免疫后10周小鼠脾脏，制成单个细胞悬液，加入5mL 0．83%NH4Cl孵育5min以溶解红细胞；1 000r／min离心5min收集淋巴细胞后用含10%小牛血清的RPMI－1640培养基重悬并调整其密度为6×106／mL，1mL／孔转于24孔板中，每孔中加入UreI抗原10μg后于37℃、5%CO2培养箱中培养72h。ELISA法检测培养上清中IL－4和IFN－γ的含量。

1．6 脾淋巴细胞增殖实验 将分离的脾淋巴细胞（1×106／mL）接种于96孔板中（200μL／孔）；对照组不加UreI抗原；实验组每孔加UreI抗原2μg，37℃、5%CO2培养箱中培养72h。随后各孔加入MTT（5g／L）20μL，继续培养4h后弃上清，加入DMSO 150μL，震荡混匀15min，570nm波长测定各孔的A值。根据刺激指数（Stimulation index，SI）大小来判断增殖程度。

1．7 ureI在小鼠肌细胞内的表达 免疫后10周，取腿部肌肉提取总DNA，以特异性引物ureI－P1／P2扩增ureI基因。同时取约0．5cm腿部肌肉浸泡于70%酒精中，制备石蜡组织切片。经烘烤，二甲苯、乙醇浸泡后，放组织切片于加热至95℃0．01 mol／L的枸橼酸钠缓冲溶液（pH6．0）中10～15 min；PBS洗涤5min；5%BSA室温封闭20min；滴加一抗（1∶500兔抗H．pylori多克隆抗体）；37℃孵育1h；洗涤、孵育二抗（FITC标记的山羊抗兔IgG），置荧光显微镜下观察拍照并保存。

1．8 统计学方法 采用SPSS 15．0统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差表示，多组比较采用one－way方差分析和Student’s t检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2．1 血清特异性抗体的检测 pcDNA3．1（＋）／ureI免疫组在免疫10周后抗体滴度达到1∶2 048，其 A 值显著升高，与pcDNA3．1（＋）以及PBS组相比，具有统计学意义（P＜0．01）。结果如表1所示。2．2 IFN－γ和IL－4表达水平的检测 ELISA结果显示，pcDNA3．1（＋）／ureI实验组小鼠脾细胞培养上清中IFN－γ和IL－4的水平明显高于pcDNA3．1（＋）组和PBS组（P＜0．01），具有统计学意义。

表1 不同免疫时间各组特异性抗体A450值Tab．1 A450of special IgG antibody in immunized mice

表2 免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN－γ和IL－4含量（x±s，pg／mL）Tab．2 IFN－γand IL－4levels in supernatant of cultured spleen cells from immunized mice

表2 免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN－γ和IL－4含量（x±s，pg／mL）Tab．2 IFN－γand IL－4levels in supernatant of cultured spleen cells from immunized mice

Note：＊＊P＜0．01VS pcDNA3．1（＋）and PBS group

Group No．mice IFN－γIL－4 PBS 10 10．78±3．52 23．87±6．94 pcDNA3．1（＋） 10 18．31±5．32 40．10±18．54 pcDNA3．1（＋）／ureI 10 275．20±43．21＊＊436．05±68．97＊＊

2．3 脾淋巴细胞增殖情况 小鼠脾淋巴细胞经纯化的 UreI蛋白刺激后，pcDNA3．1（＋）／ureI免疫组细胞增殖活性明显增强，与pcDNA3．1（＋）组及PBS对照组比较（P＜0．01），具有统计学意义（表3）。

2．4 ureI在小鼠肌细胞内表达

2．4．1 PCR检测ureI基因在小鼠肌细胞中的表达 以ureI－P1／P2为特异性引物进行基因扩增，电泳后可见1条约585bp的基因片段（图1），表明ureI基因可在肌细胞中表达。

2．4．2 免疫组化检测 图2所示，pcDNA3．1（＋）及PBS对照组小鼠组织切片几乎不见荧光，而重组质粒pcDNA3．1（＋）／ureI实验组小鼠组织切片可见黄绿色荧光，组织中由于荧光的存在而使组织轮廓在暗视野下依稀可见。

表3 免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖反应（刺激指数）Tab．3 Stimulation index （SI）of spleen cells derived from immunized mice

图1 小鼠肌细胞中ureI PCR扩增结果1．pcDNA3．1（＋）／ureI免疫后 PCR 扩增产物；2．pcDNA3．1（＋）对照组；M．DNA markerFig．1 PCR products of ureI gene in muscle cells of mice1：Products of ureI in muscle cells of mice immunized with pcDNA3．1（＋）／ureI；2：pcDNA3．1（＋）control；M：DNA marker

图2 小鼠肌肉组织ureI基因表达的免疫荧光分析（×100）A：PBS免疫组；B pcDNA3．1（＋）免疫组；C：pcDNA3．1（＋）／ureI组Fig．2 Immunofluorescence analysis of ureIexpression in muscular tissue of miceA：Muscular tissue of mice immunized by PBS；B：Muscular tissue of mice immunized by pcDNA3．1（＋）；C：Muscular tissue of mice immunized by pcDNA3．1（＋）／ureI

3 讨 论

理想的疫苗应该能够诱导机体产生高效特异的免疫保护性，且无毒或毒性较弱，便于制备。早期的动物实验研究表明：H．pylori全细胞裂解物由于抗原成分复杂，免疫效果较差、不良反应较大，已逐步被亚单位疫苗取代［10］。Myers等［11］以重组 UreB加大肠杆菌不耐热肠毒素口服免疫小鼠后，63%～100%的小鼠免受H．pylori近缘菌猫螺杆菌的攻击，表明尿素酶具有免疫保护作用。Lee等 用重组UreB加LT接种于已感染H．pylori的恒河猴，发现可减少H．pylori的胃内定植数，表明尿素酶具有免疫治疗作用。因此，Ure是目前最理想的保护性抗原之一，具有开发的潜在价值。

随着新型核酸疫苗的出现，人们开始尝试着用核酸做疫苗来预防和治疗H．pylori感染。有研究显示应用编码Hsp或UreB核酸疫苗皮内免疫小鼠引起强烈的黏膜免疫反应，大大降低了小鼠的感染率，表明核酸疫苗可以产生一定的免疫保护作用，并且具有生产简单，易于存储等许多优点［13－15］。

本研究采用pcDNA3．1（＋）／ureI重组质粒免疫小鼠后，结果表明特异性抗体的产生与免疫时间和免疫次数成正比，在免疫后4周时小鼠血清中可以检测到特异性抗体，至10周时，pcDNA3．1（＋）／ureI免疫组的抗体滴度达到1∶2 048，而整个免疫过程中pcDNA3．1（＋）和PBS免疫组均未检出特异性抗体，表明pcDNA3．1（＋）／ureI核酸疫苗能够诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答。

另外，本研究结果显示，pcDNA3．1（＋）／ureI免疫组的小鼠脾淋巴细胞经重组UreI蛋白刺激后，其增殖反应明显高于pcDNA3．1（＋）和PBS免疫组，且pcDNA3．1（＋）／ureI免疫组的细胞上清中IFN－γ的浓度明显高于pcDNA3．1（＋）和PBS免疫组，IFN－γ的表达水平在一定程度上反映了细胞免疫应答水平。因此，本研究结果表明构建的重组pcDNA3．1（＋）／ureI核酸疫苗可以诱导小鼠产生特异性的细胞免疫应答，从而证实pcDNA3．1（＋）／ureI核酸疫苗能在小鼠体内有效表达且具有较强的免疫保护性。

综上所述，我们构建的核酸疫苗pcDNA3．1（＋）／ureI通过肌肉注射C57BL／6小鼠能够在小鼠体内表达，并刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，为后续试验奠定了基础。下一步我们将构建H．pylori感染的动物模型，用来评价核酸疫苗pcDNA3．1（＋）／ureI在预防H．pylori感染和治疗H．pylori感染方面的效果，如细菌的根除率、炎症降低的程度等，为继续探索高效的人用H．pylori疫苗打下一定基础。

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