抗真菌药对复发急性弓形虫病小鼠的保护研究

吴升伟，胡国顺，王正蓉，包怀恩

弓形虫感染对免疫功能缺陷或使用免疫抑制剂的患者可造成巨大危害［1］，是免疫缺损者发生机会性感染的主要病原之一，患者可出现脑炎、肺炎及心肌炎，以及播散性弓形虫病，甚至死亡。同时资料显示，临床上免疫功能低下宿主的弓形虫病大多系原已潜伏的隐性感染的复发而非初发［2］。因此，研究复发性弓形虫病并进行治疗干预具有重要意义。

弓形虫脑炎是弓形虫感染的最严重的后果，在免疫功能低下，例如艾滋病患者较常见，而这些患者通常伴有机会性真菌感染［3］。如果抗真菌药对弓形虫病治疗有效，这不仅将减轻患者的经济负担，又利于防止过多药物副反应的发生。

目前国内外尚未见用抗真菌药对隐性弓形虫感染宿主诱导复发成急性弓形虫病的保护研究。本研究中，我们使用三唑类抗真菌药物－氟康唑或伊曲康唑治疗隐性弓形虫感染的复发，探讨其对小鼠存活率及脑组织内包囊数的影响，并与常用的抗弓形虫药物阿奇霉素比较以明确疗效，希望为患者提供一种备选的治疗方案。

1 材料和方法

1．1 实验动物6～8周龄SPF级ICR雌性小鼠，体重20～25g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；小鼠许可证编号SCXK（京）2006－0009）。

1．2 虫株 弓形虫PRU株由蚌埠医学院孙新教授和南京医科大学陈锡慰教授惠赠，本室在昆明小鼠体内传代保种。

1．3 主要试剂 阿奇霉素分散片（珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，产品批号：00902701）；氟康唑胶囊（山东绿因药业有限公司产品，批号：100101）；伊曲康唑胶囊（西安扬森制药有限公司，产品批号：101026983）；注射用环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号：11060421）。以上药物均在有效期内使用。

1．4 小鼠的感染、实验分组、标本采集及处理 90只ICR雌性小鼠分为感染组（80只）和对照组（10只），感染组小鼠经腹腔注射弓形虫PRU株10个包囊／只鼠（于试管内用无菌PBS调整至0．5mL），观察感染小鼠发病情况，急性期死亡小鼠焚烧处理。2个月后，将感染小鼠进行分组：环磷酰胺组（CTX，n＝11只）；环磷酰胺＋氟康唑组（CTX＋F），此组又按氟康唑浓度不同分为3组，即F（20mg／kg·d，n＝7只），F（30mg／kg·d，n＝7只）和F（40mg／kg·d，n＝7只）；环磷酰胺＋伊曲康唑组（CTX＋I），此组也按伊曲康唑浓度不同分为3组，即I（20mg／kg·d，n＝6只），I（30mg／kg·d，n＝6只）和I（40 mg／kg·d，n＝7只）；环磷酰胺＋阿奇霉素组（CTX＋A，n＝7只），阿奇霉素浓度为250mg／kg·d。实验中阿奇霉素的药物剂量参照文献［4］，三唑类药物剂量参照文献［5－6］，并进行调整。除外，还设置正常小鼠＋环磷酰胺（N＋CTX，n＝8只）和感染组（In，n＝7只）作对照。除In组小鼠外，各组小鼠每天腹腔注射环磷酰胺（100mg／kg·d），同时CTX＋F、CTX＋I和CTX＋A组小鼠用灌胃方法分别喂食不同浓度的氟康唑、伊曲康唑和阿奇霉素，连续用药14d。

实验组和对照组小鼠观察给药后发病及死亡情况，解剖死亡小鼠，取其脑组织，按0．5g脑组织中加入1mL PBS进行充分匀浆，取10μL匀浆液于载玻片上压片镜检，计数弓形虫包囊数量，共进行3次检测，其平均数×100即为整个小鼠脑组织的包囊数。实验结束时存活小鼠用颈椎脱臼方法处死，按前述方法处理后进行脑组织包囊计数。

1．5 统计分析 使用统计分析软件SPSS 11．5对各组小鼠脑组织包囊数据进行t检验，对生存时间进行Mann－Whitney检验。

2 结 果

2．1 临床表现 CTX组小鼠从用药第8d开始逐渐出现耸毛、怠惰、抖动、食欲下降及腹泻等临床表现，与小鼠感染弓形虫PRU株后的急性期表现一致［7］。

2．2 三唑类药物对复发小鼠存活率的影响 实验开始以前，5只未感染ICR小鼠被用高于最高剂量2倍的氟康唑或伊曲康唑溶液灌胃，连续用药14d，其间观察小鼠有无食欲减退、体重减轻、耸毛和死亡等症状，确定40mg／kg·d的伊曲康唑或氟康唑对小鼠无毒性。此外，20只感染弓形虫PRU株包囊2个月的ICR小鼠被分组进行环磷酰胺药物剂量确定实验。每组小鼠5只，腹腔注射环磷酰胺的剂量分别为50mg／kg·d，75mg／kg·d，100mg／kg·d及125mg／kg·d，连续用药14d，其间观察小鼠有无食欲减退、体重减轻、耸毛和死亡等症状，并计数脑组织内包囊数量，最后综合评价，确定实验中使用的环磷酰胺浓度为100mg／kg·d。

实验结束时（即用药14d时），CTX组小鼠全部死亡，存活率为0，CTX＋A组、N＋CTX组及In组小鼠全部存活，CTX＋A组与CTX组存活率差异有统计学意义（P＝0．016），使所有的小鼠免于死亡。氟康唑F（20mg）、F（30mg）和F（40mg）组的存活率是相同的，均为71%；伊曲康唑I（20mg）、I（30mg）和I（40mg）组的存活率分别为17%，50%和29%，氟康唑对诱导复发急性弓形虫病的小鼠的保护明显强于伊曲康唑（P＝0．000），但是由药物剂量不同所导致的各自的存活率是没有区别的。CTX组、F组、I组和A组对复发急性弓形虫病小鼠的存活情况差异有统计学意义（P＝0．000），伊曲康唑和氟康唑对复发急性弓形虫病小鼠产生的保护作用是低于阿奇霉素（P值分别为0．000和0．001）（图1）。

图1 各组感染小鼠生存情况Fig．1 Survival situation in different infected mice groupsA：CTX－P＝0．016；I：CTX－P＝0．042；I：F－P＝0．000；A：F－P＝0．001；A：I－P＝0．000；CTX：F：I：A－P＝0．000

2．3 三唑类药物对复发诱导小鼠脑组织内包囊数的影响 将实验过程中死亡小鼠及实验结束后存活小鼠用颈椎脱臼方法处死，剖解小鼠，取出脑组织，PBS充分匀浆后，取10μL脑组织匀浆液压片镜检，计数包囊数。

结果发现，CTX组与In组、F组、I组和A组比较，小鼠脑组织包囊数量明显增加了（F＝3．985，P＝0．001），但是A、I、F和In之间的包囊数差别是无统计学意义的。说明使用环磷酰胺后导致小鼠脑组织内包囊数急剧增加。尽管F组和I组三个浓度之间包囊数是不同的，但是它们均无统计学差异（F组方差分析结果：F＝0．605，P＝0．561；I组方差分析结果：F＝0．034，P＝0．967）。参见图2。

图2 感染各组小鼠脑组织包囊数Fig．2 The number of cysts in the brain from different infected mice groups＊：Significant deviation on the number of cysts between the In group and others，P＜0．05．

3 讨 论

目前用于弓形虫病治疗的药物主要有磺胺类药物和阿奇霉素等抗生素，同时许多化学性药物及中药等均对弓形虫病有一定的治疗作用，但均未找到一种毒副作用小、能完全根除弓形虫的药物。因此，寻找新的替代疗法，已经成为临床急需解决的问题。

近年来国外对抗真菌药治疗弓形虫病开展了研究。Sonda S等［8－9］对抗真菌药金担子素 A 的体外抗弓形虫活性进行了研究，发现其能够阻碍弓形虫的复制，且对哺乳动物细胞的新陈代谢无影响。E′rica dos等［5－6］观察了三唑类抗真菌药物抗急性弓形虫病的效果，发现它们能提高小鼠存活率，降低脑组织包囊负担。

本研究在对诱导复发的急性弓形虫病小鼠进行存活率观察时，发现CTX组、F组、I组及A组小鼠的存活情况差异显著。3种药物中阿奇霉素效果最好，氟康唑效果又较伊曲康唑明显。这与E′rica dos S．M．D等在急性弓形虫病小鼠模型上观察的结果一致。在对包囊进行计数时，发现CTX组小鼠包囊数明显高于其余实验组，可能原因为细胞毒性药物的使用，降低了宿主的抵抗力，促使形成大量的弓形虫包囊。CTX组与F组、I组及A组包囊数量是不一样的，说明这3种药物对弓形虫包囊的产生均有一定的抑制作用，但是均不能完全消除弓形虫包囊，可能因为大剂量的细胞毒性药物的使用，使潜伏在宿主组织中的包囊破裂，缓殖子出来，同时也不断的产生新的弓形虫包囊，包囊有着完整的囊壁，其内缓殖子代谢降低，故药物的作用力度就小；同时由于脑组织的特殊结构，导致大部分药物很难进入。实验中发现伊曲康唑组包囊数是低于氟康唑组的，但是两者无统计学意义，这与 E′rica dos S．M．D等的发现是有一定区别的：后者发现伊曲康唑能降低急性弓形虫病小鼠脑组织中的包囊负担，考虑原因为与所用的动物模型及每组的实验动物数量有很大的关系。

氟康唑和伊曲康唑均属于三唑类广谱抗真菌药，其药物代谢动力学和低毒性是众所周知的。三唑类药物抗真菌的作用机制是干扰真菌细胞膜麦角固醇的生物合成，并对真菌细胞色素P450酶系统有较强的选择性，亲和力强，但是对人类细胞色素P450酶系统亲和力差，故毒性较低，且对内分泌没有影响。现有的试验表明它们对新型隐球菌和念珠菌属等有抑菌活性，并对它们引起的全身性感染和颅内感染有效。但是三唑类药物抗弓形虫的作用机制暂时是不清楚的，这将是下一步研究的重点。

尽管阿奇霉素对弓形虫病复发的治疗效果最好，但是临床上免疫抑制病人并发弓形虫感染同时往往伴有隐球菌或念珠菌等机会性真菌感染，而对这类病人抗真菌药有阿奇霉素不具备的优点，能够使用一种药物同时治疗两种疾病，这既可以减轻药物副反应的发生，又可以降低病人的经济负担。因此，氟康唑可以考虑作为一种潜在的抗弓形虫的药物。

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