近红外双色光谱成像技术在教学中的应用

黄国韦

（汕头大学 医学院病理学教研室，广东 汕头 515041）

随着功能基因组学研究的不断深入，蛋白研究变得越来越迫切和重要.近红外双色激光蛋白检测技术，为国内蛋白功能研究者提供了极其重要的研究工具，其主要应用包括：WesternBlot检测、In CellWestern检测、EMSA和活体成像等.该技术利用近红外激光低背景，高灵敏度的特点，对蛋白及磷酸化蛋白进行准确定量检测；而且增加了蛋白定量的线性范围.本文试就其定量原理、方法及应用作一介绍，对推动广大从事基础研究的学生，特别是研究生本身的科研水平具有重要作用.

1 近红外双色成像技术的原理[1-2]

LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测.样品载体可以是膜、凝胶和微孔板.该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号.IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉.

2 近红外双色成像技术应用范围

Odyssey红外激光成像技术可以使用于蛋白定量、信号转导、激酶研究、转录调控和凋亡、药物筛选等领域.

3 近红外双色成像技术的应用举例

3.1 定量Western检测

膜经一抗孵育，再经荧光标记抗体孵育后进行Odyssey扫描成像，由于荧光信号强度与蛋白丰度具有更好的线性相关性，具备灵敏度高、定量准确、双色检测的特点.如下图所示：

图1 近红外双色成像技术进行定量Western检测

3.2 ERK磷酸化检测

观察EGF刺激后A431细胞中ERK1and ERK2(p44/42MAPkinases)的磷酸化情况,一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠抗磷酸化ERK抗体,二抗用抗兔的IRDye800标记的抗体(green),和抗鼠的Alexa680标记的抗体(red).结果如下图所示：

图2 ERK磷酸化检测

3.3 EMSA实验中的应用

EMSA(Electrophoretic Mobility ShiftAssay)凝胶迁移实验是研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术.该技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理.当蛋白质与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白，一般为转录或调控因子.起初是用32P同位素标记寡核苷酸探针,但是由于同位素的放射性很强,而且半衰期为14天,从定购同位素到标记，做完试验,必须14天完成,既不安全也不方便；地高辛标记探针的非放射EMSA实验技术，其缺陷是标记的探针纯化后灵敏度弱；红外荧光技术的出现，可以解决EMSA实验中的探针示踪问题，还可以进行双色标记，检测竞争性结合.如下图所示：

图3 近红外成像技术检测T7RNP结合到T7启动子序列

4 掌握近红外成像技术的必要性

随着医学及生物学研究的飞速发展，越来越多的科研人员希望将分子及细胞生物学技术从传统的体外研究延伸到活体动物体内，以直接监控活体生物体内的细胞活动和基因表达，有效地研究观测转基因动物生理过程，譬如活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发生发展过程等.活体动物体内光学成像分为生物发光和荧光两种技术.生物发光是利用荧光素酶基因标记目的核酸和细胞，在ATP和氧气存在时，通过荧光素酶催化注射进体内的底物荧光素，实现发光过程.荧光技术则是采用荧光素或荧光素基因标记多肽、抗体、小分子药物，在外界光源的激发下产生荧光.而传统荧光技术作为临床研究潜在的有力工具，自身的生物发光信号远弱于荧光信号，而且光在体内的传播会被散播和吸收，需要高灵敏度的检测仪器，成本非常昂贵.同时，发光几乎都是酶-底物类型的反应，需要涉及不同种类转基因细胞株或转基因动物模型，复杂程度较高，所以和荧光技术相比，更容易受反应体系中的成分影响.传统荧光由于自发荧光干扰、光的组织吸收、灵敏度较低的特点阻碍了在活体动物体内成像的应用.近红外光谱由于良好的组织渗透性、无毒性和放射性等特点，可以真正无损伤地研究各项生理指标，数据结果真实可靠.

因此，广大科研工作者应该掌握近红外成像技术，在科研工作中加以广泛的应用，必将大力推动基础科研工作的发展.

〔1〕Philip R.Christensen, Bruce M.Jakosky,Hugh H.Kieffer，et al.The thermal emission imaging system (Themis)for the Mars 2001 Odyssey mission.USA: Mars Odyssey[J].2004,110(3):85-130.

〔2〕Suresh T.Mathews,Eric P.Plaisance,Teayoun Kim.Imaging systems for westerns:chemiluminescence versus infrared detection.Methods in Molecular Biology.2009,536(5):499-513.