四川奶牛腐蹄病主要病原菌调查

谢 晶，廖党金，汪 明，何万平，曹 冶，赵素君，曾 伟，李江凌，潘保良，叶勇刚，罗丹丹

（1．四川省畜牧科学研究院，四川 成都610066；2．中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193；3．四川省洪雅县畜牧兽医局，四川 洪雅620300；4．四川阳平种牛公司，四川 洪雅620300）

奶牛腐蹄病是奶牛场最常见的疫病之一，在我国各地都表现出较高的发病率，尤其是在我国南方，其高温、高湿、集约化饲养等自然条件，奶牛场的腐蹄病更为严重。腐蹄病的发生引起奶牛产奶量下降，繁殖率，饲料报酬降低，治疗成本增加，严重者常常导致奶牛过早淘汰，从而造成巨大的经济损失。据统计，舍饲牛群中发病率高者可达到30%～40%，目前我国每年因腐蹄病被迫淘汰的奶牛占淘汰总数的15%～30%，给奶牛业造成经济损失达2 250万元［1］。关于牛腐蹄病的病原，一直存在着争议，多数学者认为牛和绵羊感染性蹄病的主要病原体是坏死梭杆菌和节瘤拟杆菌，该病的发生主要是由坏死梭杆菌和节瘤拟杆菌共同感染而引起的，节瘤拟杆菌感染动物的蹄部之后，将其蹄部皮肤和基层的完整性破坏，为坏死梭杆菌对蹄部的侵入和感染创造了有利的条件，坏死梭杆菌感染表面损伤的蹄部后引起蹄部组织的化脓、坏死以及全身的病理变化。在腐蹄病病原中，除主要病原坏死梭杆菌和节瘤拟杆菌外，还有产黑色素拟杆菌，脆弱拟杆菌以及其他化脓坏死微生物区系，如产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和化脓棒杆菌等并发感染。此外，螺旋体、粪弯杆菌、变形杆菌、球菌、酵母、微球菌［2－5］。

四川省奶牛养殖主要分布在成都、洪雅、南充、眉山、雅安、巴中、达州、西昌等大中城市郊区，养殖数量占全省养殖数量的80%左右。其中成都、洪雅、眉山等地地处四川盆地，属于亚热带湿润气候，气候温和，雨量丰沛，5～9月份为降雨集中时段，降雨量占年总降雨量的85%左右，也是奶牛腐蹄病高发季节。在这种高温高湿地区奶牛因患蹄病淘汰率高达31．8%，在管理较好的奶牛场，淘汰奶牛中因腐蹄病淘汰的奶牛约占15%。腐蹄病是四川奶牛养殖中常见疾病，是影响奶牛产奶质量主要原因之一，在规模化牛场主要采用硫酸铜浴蹄和抗生素治疗［6－7］。由于不清楚感染性蹄病的主要致病菌类型和分布，在抗生素应用上存在很大盲目性，造成用药成本高并存在药物残留的风险，开展奶牛腐蹄病病原调查和药物敏感试验研究为该地区奶牛腐蹄病的科学、有效的防治及奶牛养殖业的持续健康发展具有重要意义。

1 材料与方法

1．1 材料 牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，琼脂粉，氯化血红素，半胱氨酸等化学试剂为国产分析纯。清洁型小鼠购自华西医大。药敏片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1．2 临床样本采集 在洪雅、金堂、眉山、邛崃等8个规模在200头以上的奶牛场进行奶牛腐蹄病样本的采集。患蹄先经驻场兽医修剪后，用无菌生理盐水冲洗，用无菌活性炭棉拭子抹取患病部位，或无菌剪开化脓部位，用无菌活性炭棉拭子抹取深部脓汁，每个样本采集3个棉拭子，一个立即放入已经还原的心脑浸液液体培养基试管，将试管放入玻璃干燥器内，厌氧处理后用凡士林密封干燥器，送回实验室；第2个棉拭子放入灭菌营养肉汤培养基，送回实验室；用第3个棉拭子将病料涂于载玻片上，干燥经火焰固定后带回实验室用革兰染色法染色镜检，观察细菌形态。

1．3 细菌的分离 将已经采集样本的干燥器和肉汤培养基于37℃进行厌氧和需氧培养48～96h，沾取培养液转接到心脑浸液固体培养基、卵黄培养基、营养肉汤培养基划线培养，分别进行需氧和厌氧培养，分离单个菌落，根据细菌在不同培养基的菌落形态进行分类，对同一类型的单菌落挑取2～3个进行革兰染色镜检，再将染色特性相似的归类，并将单个菌落在液体培养基中扩大培养，制成20%甘油菌液于－20℃保存备用。

1．4 小鼠致病性试验 将分离的厌氧菌单个菌落接种于心脑浸液培养基进行厌氧纯培养，需氧菌单个菌落接种于营养肉汤培养基进行需氧纯培养，勾取纯培养物接种于相应的培养基培养24h，接种小鼠5只，每只腹腔注射0．2mL，观察分离细菌对小鼠的致病性。对死亡小鼠进行剖检，无菌采集肝脏、心血进行细菌的再分离培养，获得的单个菌落进行扩大培养，并制备甘油菌于－20℃和液氮保存。另外，单个菌落进行革兰染色镜检。

1．5 致病细菌鉴定 将对小鼠致病的细菌复壮，纯培养物采用美国Biolog公司的Microstation仪器进行细菌鉴定。

1．6 药敏试验 采用纸片扩散法进行药敏试验。挑取分离病原菌纯培养，单菌转接至相应的液体培养基，吸取一定量过夜培养菌液涂布于相应的固体培养基，用无菌镊子将临床常用抗生素药敏纸片分别贴于培养基表面，置37℃培养箱厌氧或需氧培养12～24h后，观察并测定抑菌情况。

2 结果

2．1 致病细菌的分离和鉴定 棉拭子病料涂片革兰染色镜检，均可观察到不同细菌形态。共分离到细菌45株，经过小鼠致病性试验，获得致病性细菌20株，生化鉴定为大肠杆菌（11／20），坏死梭杆菌（4／20），普通变形杆菌（1／20），奇异变形杆菌（2／20）和一种梭状芽孢杆菌（2／20）。其中，坏死梭杆菌致死小鼠注射部位形成干酪样脓肿。各致病菌菌落形态以及镜检形态见表1。

表1 致病菌生长特性及形态特征

2．2 药敏试验结果 致病菌药敏试验结果（见表2）表明，奇异变形杆菌和普通变形杆菌对抗生素的敏感性类似，大肠杆菌分离株对抗生素的敏感性有所不同，坏死梭杆菌对林可霉素和洁霉素最敏感。

表2 致病菌药敏试验

3 讨论

因为奶牛养殖地区、环境的不同，养殖卫生的不同，奶牛腐蹄病感染的病原微生物区系比较复杂。本试验对四川主要奶牛养殖区进行了奶牛腐蹄病病原的调查，发现牛腐蹄病病原有大肠杆菌、坏死梭杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌和梭状芽孢杆菌。大肠杆菌和变形杆菌属是人和动物肠道的正常寄居菌，广泛存在于泥土、水和粪污中，是人和动物感染的重要条件致病菌，且其感染具有持久性和难治性，因此，养殖环境的卫生条件控制至关重要。在分离病原菌时，由于采集的病料的方法和分离的不同，可能会造成一些条件致病菌在分离过程中丢失。另外，由于采样的患病奶牛多已经进行过抗生素治疗，在病料涂片镜检时8个奶牛场均观察到典型的呈串珠状或细长杆状的坏死梭杆菌，但是在病原菌分离过程中却只有很少机会分离到其单个菌落。本次分离到的梭杆菌属芽孢杆菌在文献中未见报道，有待进一步深入研究。

从药敏试验结果可知，分离的引起四川奶牛腐蹄病的病原菌对大多数抗菌药物具有较好的敏感性，在临床上多选用敏感、药残较低的药物结合综合防制措施进行治疗。

［1］ 邹静．西昌市奶牛腐蹄病的诊治［J］．畜禽业，2010，258：82－84．

［2］ 苏晓健，赵永旺，徐小琴，等．牛腐蹄病病原微生物的分离鉴定［J］．黑龙江畜牧兽医（科技版），2009，11：92－93．

［3］ Tan Z L，Nagaraja T G，Chengappa M M．Fusobacterium necrophorum infections：virulence factors，pathogenic mechanism and control measures［J］．Vet Res Commun，1996，20：113－140．

［4］ Nagaraja T G，Narayanan S K，Stewart G C，etal．Fusobacterium necrophorum infections in animals：pathogenesis and pathogenic mechanisms［J］．Anaerobe，2005，11：239－346．

［5］ Cruz C E F，Pescador C A，Nakajima Y，etal．Immunopathological investigations on bovine digital epidermitis［J］．The Veterinary Record，2005，157：834－840．

［6］ 周贤光．奶牛腐蹄病的防治［J］．四川畜牧兽医，1993，（3）：39－40．

［7］ 廖党金，汪明，谢晶，等．四川省荷斯坦奶牛疾病调查分析［J］．中国奶牛，2010，（2）：35－36．