贝类派琴虫二温式PCR检测方法的建立及初步应用

谢丽基，谢芝勋，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢志勤，范 晴

（广西壮族自治区兽医研究所 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西 南宁530001）

随着海水养殖规模的日益扩大及密度的持续增高，贝类的病害也频繁出现，其中奥尔森派琴虫（Perkinsus olseni）感染的危害较大，在我国［1］、韩国［2］和日本［3］均有过报道。奥尔森派琴虫感染是海水养殖贝类最为常见的病害之一，可引起贝壳不能闭合，套膜收缩，性腺发育抑制，生长缓慢，偶尔也会出现脓肿，死亡率可高达95%［4］。

目前派琴虫的检测有雷氏液体巯基醋酸盐培养基（RFTM）法和ELISA 方法等［1，5］。但这些方法均存在一定的局限性。RFTM方法缺乏专一性，检测用时需7d以上，且只能检测到派琴虫的休眠孢子，而ELISA检测方法的敏感性较差。病原检测、筛选建立无特定病原体的健康群，仍然是目前预防与控制派琴虫的最有效办法。PCR方法具有操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已成为检测派琴虫的重要方法［6］。

二温式聚合酶链反应，即二温式PCR，又称双温PCR、或二温度点法PCR和二温度梯度PCR，是根据经典PCR技术原理，对标准PCR进行改进，将退火和延伸合并为一个温度，比标准PCR的退火温度高，提高了反应的特异性，缩短了检测时间［7－8］。近年来该方法应用比较广泛，主要用于水产品、哺乳动物、禽类及植物中病原菌的快速检测。目前国内还未见有建立派琴虫二温式PCR检测方法的报道，本研究设计了一对特异性引物，建立了派琴虫的二温式PCR快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 PCR试剂盒及pMD18－T试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA片段回收试剂盒和海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，购自广州东盛生物科技有限公司。PCR仪为美国Perkin Elmer Cetus公司生产的PE9600仪。

1.2 病原体和质粒DNA 派琴虫、单孢子虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等由本室保存；pMD－Perkinsus质粒由本实验室构建保存［9］。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank中派琴虫的保守序列，通过Blast验证，设计了1对特异性引物P276－1和 p276－2，扩增大小为276bp。引物由TaKaRa公司合成，序列如下：

1.4 核酸抽提 取待检贝类的鳃组织约100mg，匀浆后根据海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的说明书提取DNA。对病原体DNA的抽提按同样方法进行。

1.5 二温式PCR扩增介质及各反应条件的优化在50μL的反应体系中含：25mmol／L MgCl22.5 μL，10×PCR Buffer 5μL，10mmol／L dNTP 1 μL，Taq聚合酶5单位0.25μL，适当浓度的上游引物和下游引物，模板1μL。以抽提的派琴虫DNA为模板，对二温式PCR各循环参数和各引物浓度等进行优化，以确定最佳的二温式PCR模式。

1.6 二温式PCR特异性试验 对已提取的派琴虫、单孢子虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的DNA进行扩增，检验所建立的二温式PCR的特异性。

1.7 二温式PCR的敏感性 测定pMD－Perkinsus质粒的含量后，按10倍递增稀释成10ng、1ng、100 pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg、0.01fg、0.001fg，分别加入到最佳的二温式PCR反应体系中进行扩增，检测模板的最低检测量。

1.8 临床样品的检测 应用本研究所建立的二温式PCR方法，对2012年采自广西225份牡蛎、41份贻贝、40份文蛤，连云港的48份菲律宾蛤仔，温州的102份溢蛏和58份血蛤进行检测。

1.9 二温式PCR产物的电泳分析及克隆测序 对1.8中检测为阳性的牡蛎、菲律宾蛤仔和溢蛏，取50 μL二温式PCR产物进行凝胶电泳，在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用凝胶回收试剂盒纯化回收。取适量纯化回收的二温式PCR产物，与pMD18－T于16℃连接过夜，转化DH5α大肠埃希菌。挑取阳性克隆菌送宝生物工程（大连）有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对分析。

2 结果

2.1 二温式PCR条件优化 通过对二温式PCR的引物浓度、各反应温度、时间及循环次数等进行优化，最后确定二温式PCR中P276－1和p276－2引物的最佳工作终浓度为0.3μmol／L，二温式PCR的最佳反应模式为94℃变性5min，然后进入94℃变性30s，65℃退火30s，共进行32个循环，最后再经65℃延伸10min后，于4℃结束反应。

2.2 二温式PCR特异性扩增结果 应用最佳反应体系，对派琴虫、单孢子虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的核酸进行PCR扩增，结果仅有派琴虫能扩增出与试验设计大小相符的DNA扩增带；而其他对照病原体DNA在相同位置却无任何DNA扩增带（图1）。

图1 二温式PCR的特异性试验

2.3 二温式PCR的敏感性扩增结果 经过敏感性测定，该二温式PCR最低能检出1fg的pMD－Perkinsus质粒模板（图2）。

图2 敏感性试验

2.4 临床样品的检测 应用建立的二温式PCR方法，对2012年采自广西225份牡蛎、41份贻贝、40份文蛤，连云港的48份菲律宾蛤仔，温州的102份溢蛏和58份血蛤进行检测，结果广西的牡蛎检出派琴虫27份，连云港的菲律宾蛤仔检出派琴虫12份，温州的溢蛏中检出6份（部分检测结果见图3），而其他未检出。

图3 部分临床样品检测的结果

2.5 测序结果与序列分析 经测序结果分析及Blast比对分析，证明了牡蛎、菲律宾蛤仔和溢蛏的派琴虫PCR扩增产物，大小为276bp，与设计大小相符。PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致。说明本研究建立的二温式PCR方法，适用于贝类派琴虫的检测。

3 讨论

一般PCR仪的升温速度为4℃／s，68℃到80℃升温时间约为3s；Taq DNA聚合酶活性最佳温度为72℃，此温度下的延伸速度为150bp／s～300bp／s，对于相对较短的DNA片段，可将退火、延伸温度合并为一个温度，在较短时间内引物与模板退火结合已经充分延伸形成产物片段，因此采用二温式PCR能产生与三步PCR同样多的产物。因此，本试验在设计引物时，有意识的提高了引物的Tm值，使引物与模板能准确结合而且稳定性好，以减少非特异扩增。

本试验所建立的派琴虫二温式PCR方法，具有操作简便、检测快速、敏感性高和特异性强等优点，目前还未见有建立派琴虫二温式PCR检测方法的报道。本试验建立了派琴虫的二温式PCR检测方法，全程（包括核酸提取、二温式PCR扩增和电泳）仅需约5h，比常规PCR［10］检测时间缩短1h。该二温式PCR对派琴虫扩增出与设计大小相符的276 bp条带，而对其他5种病原体则均不能扩增出任何条带，具有很好的特异性；同时该二温式PCR检测方法的敏感性最低可检测到1fg的pMD－Perkinsus模板，说明该二温式PCR检测方法具有很高的敏感性，这对于在贝类派琴虫的发病早期提供准确的诊断结果，切断其传播途径有重要意义，同时也是选育建立无派琴虫病的健康贝类养殖群所必要的。

应用建立的二温式PCR方法，对2012年采自广西225份牡蛎、41份贻贝、40份文蛤，连云港的48份菲律宾蛤仔，温州的102份溢蛏和58份血蛤进行检测，结果广西的牡蛎检出派琴虫27份，连云港的菲律宾蛤仔检出派琴虫12份，温州的溢蛏中检出6份，检测结果表明，在广西牡蛎、连云港的菲律宾蛤仔和温州的溢蛏中存在派琴虫的感染，在国内首次检出溢蛏中存在派琴虫的感染，提示我们在贝类的养殖中应特别注意防治派琴虫的感染。

［1］Hine P M and Thorne T，Haplosporidium S P.（Alveolata：Haplosporidia）associated with mortalities among rock oysters Saccostrea cuccullata in north Western Australia［J］.Dis Aquat Organ，2002，51（2）：123－33.

［2］Spencer Russell，Salvatore Frasca J，Inke Sunila，et al.Application of a multiplex PCR for the detection of protozoan pathogens of the eastern oyster Crassostrea virginica in field samples［J］.Dis Aquat Org，2004，59：85－91.

［3］Haskin H H，Stauber L A，Mackin J A.Minchinia nelsoni n sp（Haplosporidia Haplosporidiidae）：causative agent of the Delaware Bay oyster epizootic［J］.Science，1966，153：1414－1416.

［4］Barber B J，Langan R，Howell T L.Haplosporidium nelsoni（MSX）epizootic in the Piscataqua River Estuary（Maine／New Hampshire，USA）［J］.J Parasitol ，1997，83：148－150.

［5］Sunila I，Karolus J，Volk J.A new epizootic of Haplosporidia（MSX），a haplosporidian oyster parasite，in Long Island Sound［J］.J Shellfish Res，1999，18：169－174.

［6］谢丽基，谢芝勋，庞耀珊，等.贝类单孢子虫PCR检测方法的建立［J］.中国畜牧兽医，2010（1）：54－56.

［7］王振宝，刘启生，哈森，等.牛环形泰勒虫病二温式PCR诊断方法的建立及初步应用［J］.动物医学进展，2012，33（5）：59－63.

［8］庞耀珊，谢芝勋，谢志勤，等.二温式PCR检测对虾白斑综合征病毒［J］.中国兽医杂志，2003，39（4）：43－45.

［9］谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.贝类奥尔森派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用［J］.中国病原生物学杂志，2009，4（7）：517－519.