替来他明—唑拉西泮合剂对大鼠脑皮质突触体钙动力学的影响

石星星，尹柏双，2，李小波，李志强，王洪斌

（1．东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；2．吉林农业科技学院动物医学学院，吉林 吉林132101）

钙离子（Ca2＋）是维持机体细胞正常生理功能的重要离子，作为第二信使传递信息并调控一系列生命过程，如基因转录，蛋白质的合成与分解，细胞的生长等［1］。许多研究表明，钙离子通过电压门控钙通道内流引起突触体［Ca2＋］i增加，触发神经递质的释放［2］。替来他明为苯环己哌啶类静脉全身麻醉药，唑拉西泮是苯二氮卓类镇静剂，将其1∶1复合制成Zoletil（欧洲）或 Telazol（美国）［3］，国外广泛应用于动物的麻醉［4］，其麻醉机理尚不完全清楚。范宏刚研究表明，随着替来他明剂量的增加，丘脑和小脑Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性呈现出剂量依赖性抑制的趋势［5］，提示其麻醉作用可能与中枢神经系统钙稳态有关。本试验通过研究替来他明－唑拉西泮合剂对大鼠大脑皮质突触体钙动力学的影响，探讨替来他明－唑拉西泮合剂麻醉与突触体钙离子的关系，探究该药物的部分全麻分子机理。

1 材料与方法

1．1 试验材料及动物 替来他明－唑拉西泮，购自法国维克制药公司；Fluo－3－AM，购自 Molecular Probes公司；Triton X－100，购自碧云天生物技术研究所。SD纯种大鼠6只，雌雄兼备，体重220±20 g，12～15周龄，购自哈尔滨市汉方实验鼠类养殖所。

1．2 试验分组 试验分为对照组、低浓度药物组（替来他明－唑拉西泮合剂终浓度为100μmol／L）、中浓度药物组（替来他明－唑拉西泮合剂终浓度为200μmol／L）、高浓度药物组（替来他明－唑拉西泮合剂终浓度为400μmol／L）。

1．3 突触体的制备 参照Gray和Whittaker的方法［14］，略作修改。简述之，取SD大鼠消毒，断头处死后迅速分离大脑皮质于匀浆器中，按1∶10（W／V）的比例加入预冷（4℃）的0．32mol／L蔗糖溶液并匀浆。匀浆液1 500r／min离心10min。取上清液缓慢滴加在2mL预冷的1．2mol／L蔗糖溶液表面，9 000r／min离心20min。缓慢吸取含有突触体的中间梯度带，用0．32mol／L蔗糖溶液稀释3～3．5倍后滴加在8mL预冷的0．8mol／L蔗糖溶液表面，9 000r／min离心25min。吸取下层液相，加入等体积预冷的人工脑脊液后20 000r／min离心10 min，弃上清，沉淀用预冷的人工脑脊液重悬，放入4℃待用。

1．4 Fluo－3－AM负载 将制备的突触体悬浮于人工脑脊液1h后加入钙荧光指示剂Fluo－3－AM（终浓度为5μmol／L），37℃，避光恒温振荡30min。孵育负载后用人工脑脊液洗涤3次，室温放置15 min，确保AM体的完全去酯化作用。

1．5 突触体［Ca2＋］i的检测 采用荧光分光光度计检测，激发光488nm，发射光530nm。测样品荧光值F，再加入终浓度为0．1%Triton X－100测荧光值Fmax，加入终浓度为5mmol／L的EGTA测荧光值Fmin，按以下公式求出［Ca2＋］，［Ca2＋］＝iiKd× ［（F－Fmin）／（Fmax－F）］，Kd为400nmol／L。1．6 统计分析 试验数据以均数±标准差（±SD）表示，用SPSS 13．0软件对试验数据进行统计分析，组间比较采用t检验。

2 结果

结果见表1所示。加入替来他明－唑拉西泮合剂后，突触体内游离钙离子浓度显著升高，与对照组比较差异极显著（P＜0．01）；随着替来他明－唑拉西泮合剂浓度的增加，突触体内游离钙离子浓度逐渐升高；高浓度组中突触体内游离钙离子浓度明显高于中、低浓度组，差异显著（P＜0．05）；中浓度组与低浓度组间比较差异不显著（P＞0．05）。

3 讨论

钙离子在神经元内有发动动作电位、节律性发放、突触的生长、基因表达和递质释放等多种功能。钙离子通过电压门控钙通道进入突触前神经末梢引起［Ca2＋］i增加，是调控神经递质释放的关键环节。具有完整膜结构的突触体是目前麻醉药对突触前作用的良好研究模型。

表1 替来他明－唑拉西泮合剂对大鼠脑皮质突触体钙离子浓度的影响 （±SD，n＝6）

表1 替来他明－唑拉西泮合剂对大鼠脑皮质突触体钙离子浓度的影响 （±SD，n＝6）

##：药物组与对照组比较差异极显著（P＜0．01）；＊：药物合剂组间比较差异显著（P＜0．05）

组别 ［Ca2＋ ］i（nmol／L）对照组647．62±3．54合剂低剂量组 834．25±11．88##合剂中剂量组 839．44±15．49##合剂高剂量组 1 061．77±10．17##＊

近年来有关麻醉剂和突触钙离子关系的报道结果不一。张军（2005）利用依托咪酯研究表明，依托咪酯对KCl诱发突触体内钙离子升高的抑制程度呈浓度依赖性［6］。Ito（2011）等认为，异丙酚和苯巴比妥可抑制兴奋性突触前钙离子的增加，从而影响其神经递质的释放［2］。Fang（1998）对大鼠大脑皮层游离神经元末梢的研究表明，吸入麻醉药异氟醚和氟烷影响突触前钙离子动力学，抑制钙离子通道，而导致Ca2＋浓度降低［7］。王金波等（2001）研究报道，异丙酚和异氟醚作用于心肌细胞膜上的L－型钙离子通道，抑制钙离子跨膜内流，对心肌收缩性产生不同程度的影响［8］。国内外尚未发现有关替来他明及唑拉西泮和突触体内钙离子浓度关系的文献报道。有少量关于替来他明及唑拉西泮和神经递质关系的研究。如张燕［9］的研究发现，替来他明引起大脑皮层抑制性神经递质γ－氨基丁酸（GABA）含量显著升高。Chaudhary等（2003）认为唑拉西泮能促进GABA 的释放［10］。

本试验研究结果表明，替来他明－唑拉西泮合剂使钙离子内流引起突触体内钙离子浓度升高，钙离子作用于突触囊泡促使抑制性神经递质（GABA、Gly）释放增加，降低突触后神经元的兴奋性，发挥抑制效应，使替来他明－唑拉西泮合剂产生全麻作用。

4 结论

试验结果表明，替来他明－唑拉西泮合剂引起大鼠脑神经突触间隙钙离子内流使突触体内钙离子浓度升高，作为第二信使传递麻醉信息，促使突触囊泡释放抑制性神经递质可能是其产生全麻作用的机理之一。

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［4］ Kim M，Kim D，Choi U．Penile Extramedullary Plasmacytoma in a Dog［J］．Reprod Domest Anim，2010，45（6）：454－457．

［5］ 范宏刚，卢德章，胡魁，等．噻环乙胺对大鼠不同脑区突触体Ca2＋、Mg2＋－ATP酶活性的动态影响［J］．中国兽医杂志，2010，46（10）：89－91．

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［9］ 张燕．噻环乙胺及小型猪复合麻醉剂（XFM）对大鼠不同脑区神经递质含量的影响［D］．哈尔滨：东北农业大学，2010：6，67．

［10］Chaudhary V，Hansen R，Lindgren H，etal．Effects of telazol and nembutal on retinal responses［J］．Doc Ophthalmol，2003，107（1）：45－51．