桃金娘果实中多糖的提取与含量测定

陈筱云 罗朝晖

1.柳州市红十字会医院药剂科，广西柳州 545001；2.桂林医学院，广西桂林 541004

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk），俗称山稔子、岗稔、当梨等，为桃金娘科植物桃金娘果实。分布于江西、福建、台湾、广东、海南、广西、云南及贵州等省区。果实成熟完全时极甜，略有涩味，汁液呈诱人的紫红色，富含多糖、黄酮类、酚类、氨基酸、有机酸等多种化学成分，我国民间素有将其泡酒饮用的习惯，有“养血，止血，涩肠，固精”的功效[1-2]。因此，它具有较高的研究和开发利用价值。

多糖是由10个以上单糖通过苷键连接而成的糖。自然界分布极广，目前已发现数百种多糖具有多种生物活性，如具有提高免疫功能，抗衰老，抗肿瘤，抗病毒，抗溃疡，降血糖，降血脂，抗氧化，抗自由基和增加各类细胞因子表达的作用[3]。本文采用水提醇沉法提取桃金娘多糖，用苯酚-硫酸法测定其含量，为开发利用桃金娘资源提供理论依据。

1 主要仪器、试剂及材料

BT224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；紫外分光光度计（日本岛津UV-2550）；R-201型旋转蒸发仪及201-恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；电热套；离心机；干燥箱；循环水式真空泵。

标准葡萄糖、苯酚，浓硫酸、石油醚（60～90℃）、95%乙醇、氯仿、正丁醇、无水乙醇、乙醚、丙酮均为分析纯。

桃金娘果实采于桂林市永福县（9～10月份），药材经桂林医学院生药教研室杜泽乡副教授鉴定，为桃金娘科植物桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa（Ait.）Hassk）果实，冷藏保鲜。

2 实验方法

2.1 桃金娘多糖提取工艺

称取新鲜桃金娘果实500 g，用剪刀稍剪开后置2000 mL圆底烧瓶中，加石油醚900 mL，80℃水浴回流提取1.5 h，重复提取1次（600 mL，1 h），滤出溶剂，滤渣挥干溶剂后加80%乙醇1000 mL，浸泡过夜（约13 h）后90℃水浴回流提取1 h，重复提取1次（500 mL，1 h），滤过，滤渣挥干溶剂后加600 mL蒸馏水95℃水浴回流提取1 h，再重复提取3次，合并4次提取液，减压浓缩至200 mL，以每100 mL浓缩液加20 mL氯仿-正丁醇（4：1）液，置分液漏斗中振摇20 min，离心15 min，去除下层氯仿及中层变性蛋白，取上部水层再重复操作至无明显中层为止。上清液加3倍量95%乙醇沉淀多糖，4℃冰箱放置45 h，抽滤，沉淀依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤4次（20 mL/次），得桃金娘多糖，置60℃烘箱干燥至恒重得2.78 g，放入干燥器中保存备用[4]。

2.2 苯酚溶液的配制

加热苯酚使其溶解，趁热取100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g置150 mL圆底烧瓶中，电热套加热（182℃）蒸馏收集馏分至棕色瓶中备用，趁热从中精密称取5 g置100 mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度，即得5%苯酚溶液（临用前新配）[5]。

图1 最大吸收波长扫描图

2.3 葡萄糖标准溶液的配制

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1014 g置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀后从中精密吸取10.0 mL置100 mL容量瓶定容至刻度，即得0.1014 mg/mL的标准葡萄糖溶液。

2.4 最大吸收波长的选择

精密吸取0.1014 mg/mL标准葡萄糖溶液1.0 mL，置10 mL具塞试管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，混匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，混匀，阴暗处放置10 min后置沸水浴中加热15 min，取出立即冷却后阴暗处放置20 min。以蒸馏水同法操作为空白对照，于400～550 nm波长范围内扫描，结果在487 nm处有最大吸收（如图1），因此选择测定波长为487 nm。

2.5 标准曲线的绘制

精密吸取0.1014 mg/mL标准葡萄糖溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9 mL分别置10 mL具塞试管中，再分别加蒸馏水至1.0 mL，然后分别加5%苯酚溶液1.0 mL，混匀，再迅速加浓硫酸5.0 mL，混匀，阴暗处放置10 min后置沸水浴中加热15 min，取出后立即冷却，阴暗处放置20 min，以蒸馏水1.0 mL同法操作为空白对照，照紫外分光光度法在487 nm处测定吸光度A，以葡萄糖浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，做回归处理，得回归方程为A=0.07376C+0.0036，相关系数r2=0.99967，葡萄糖在1.449～13.037 μg/mL范围内与A呈良好的线性关系[6]。

2.6 换算因子的测定

精密称取干燥至恒重的桃金娘多糖21.67 mg置100 mL容量瓶中，加温热的蒸馏水溶解并稀释至刻度，从中精密吸取1.0 mL，3份分别置10 mL具塞试管中，照标准曲线制作项下方法自“加5%苯酚溶液1.0 mL起，依法测定吸光度，求平均吸光度、RSD。由回归方程求出该多糖液中葡萄糖的浓度C，按下式计算换算因子。换算因子f=W/CD（式1）[7]。

式中W为称取多糖的重量μg；C为该多糖液中葡萄糖的浓度μg/mL；D为多糖的稀释倍数。

2.7 样品中桃金娘多糖的含量测定[7]

2.7.1 样品溶液的制备 取桃金娘鲜果一个精密称取得1.8480 g，置150 mL圆底烧瓶中，用玻棒稍压破后加80%乙醇50 mL，90℃水浴搅拌回流提取1 h，趁热抽滤，滤渣用80%乙醇洗涤两次，挥干溶剂后加热水60 mL于95℃水浴搅拌回流提取2 h，抽滤，滤渣用热水多次洗涤，滤液用容量瓶定容至200 mL，即得样品溶液。

2.7.2 样品溶液中多糖的含量测定 精密吸取样品溶液1.0 mL（3份），置10 mL具塞试管中，照2.5方法测定吸光度A，由回归方程计算样品溶液中葡萄糖的浓度C，按照下式计算含量。

多糖含量（%）=CDf/W×100%（式2）

式中D为样品溶液的稀释倍数，W为样品的取样量（μg），f为换算因子，C为样品溶液中葡萄糖的浓度（μg/mL）。

2.8 方法学考察

2.8.1 稳定性试验 精密吸取样品溶液1.0 mL，置10 mL具塞试管中，照2.5方法测定吸光度A，每隔30 min测定一次，共测4次（2 h内），考察生成物颜色的稳定性。

2.8.2 重现性试验 取桃金娘鲜果3个，分别精密称取得1.8480、1.7869、1.7351 g，照2.7.1项下制备得溶液a、b、c，每份精密吸取1.0 mL各3份共9份，分别置10 mL具塞试管中，再照2.5方法测定吸光A，计算多糖的含量并求平均值。

2.8.3 加样回收率试验 精密吸取样品溶液5.0 mL，3份分别置10 mL容量瓶中，再按高、中、低三个浓度分别加0.1014 mg/mL的标准葡萄糖溶液2.7、3.4、4.1 mL，加水定容至10 mL，即得加样液①、②、③，从中各取1.0ml3份共9份分别置10 mL具塞试管中，照2.5方法测定吸光度A，计算加样回收率。

3 实验结果与结论

3.1 实验结果

3.1.1 换算因子 测得的数据A1=0.756，A2=0.739，A3=0.733，平均吸光度A=0.743，RSD=1.61%＜2%，将A代入回归方程A=0.07376C+0.0036得C=10.024μg/mL

由式1计算换算因子f=W/CD=21.67×103/10.024×700=3.088

3.1.2 多糖含量及重现性 由回归方程求出样品液中葡萄糖的浓度C（μg/mL），由式2计算多糖平均含量为2022%，RSD=4.13%，可见重现性较好，方法可行。

3.1.3 稳定性 苯酚-硫酸显色后，样品溶液在2 h内吸光度在0.725～0.733之间，基本稳定。

表1 加样回收率结果

3.1.4 加样回收率 测得数据及计算结果见表1，证明了该含量测定的方法可靠。

3.2 实验结论

本实验通过水提醇沉法从桃金娘鲜果中提取了多糖，得到浅棕色片状桃金娘多糖，苯酚-硫酸显色呈棕红色。用苯酚-硫酸比色法测定桃金娘鲜果中多糖的含量，最大吸收波长为487 nm，显色条件为1.0 mL，5%苯酚溶液、5.0 mL浓硫酸、反应时间15 min，浓度在1.449～13.037 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，测得多糖含量为2.22%。可见，用该方法测定桃金娘果实中多糖的含量是可行的，其方法稳定可靠，简单易行，为研究桃金娘果实中的多糖成分提供实验依据。对于其他提取与含量测定的方法及该多糖组分的鉴定还有待进一步研究。

[1] 赵新先.原色中草药图集[M].广州：世界图书出版社，2003：20-21.

[2] 秦小明，隋亚君，宁恩创.桃金娘果实多糖的构造研究[J].食品科学，2005，26（4）：79.

[3] 刘吉成，牛英才.多糖药物学[M].北京：人民卫生出版社，2008：9-10.

[4] 季宇彬.中药多糖的化学与药理[M].北京：人民卫生出版社，2005：119.

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[6] 吕培霖，晋玲，郑明霞.不同产地款冬花多糖含量测定[J].现代中西医结合杂志，2009，18（15）：1758.

[7] 孙文基，谢世昌.天然药物成分定量分[M].北京：中国医药科技出版社，2003：538-539.