考马斯亮蓝法测定核桃水溶性蛋白含量的研究

柳 荫，吴凤智，陈 龙，王晓丹，邱树毅，周鸿翔*

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药省级重点实验室，贵州 贵阳 550025）

近年来，基因工程学、分子生物学和现代分离技术快速发展，蛋白质也作为一项质量和资源评价的指标[1]，目前测定蛋白质含量的常用方法有凯氏定氮法、考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue，CBB）染色法、紫外分光光度法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）等[2-3]，有关文献报道CBB法优于其他的方法[4-7]。

牛血清白蛋白是极为常用的标准参照蛋白，其质量限定条件一般要求蛋白质含量在80%以上（凯氏定氮法测定）。在10d～50d范围内，以凯氏定氮法测定的牛血清白蛋白质含量未见明显规律性变化，但呈下降趋势；而氨基酸含量呈逐渐增加趋势，表明在4℃条件下牛血清白蛋白存在降解现象[8-9]。因此，牛血清白蛋白溶液配好尽快做标准曲线。

在利用分光光度计测量吸光度值时，所用的比色皿应该是塑料的或玻璃的。并且用之前应绝对保证清洗干净，禁止使用石英（成分为二氧化硅）比色皿，因为染料会跟二氧化硅发生共价结合[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试样品为核桃蛋白（实验室自制）；牛血清白蛋白：购于Solarbio公司；考马斯亮蓝G-250：购于Beyotime公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV2550紫外可见分光光度计：日本岛津公司；TDL-40B离心机：上海安亭科学仪器厂；FW177粉粹机：天津泰斯特仪器有限公司；101-3A鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；JA1003N电子精密天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.3 实验原理

考马斯亮蓝G-250存在着红色和蓝色2种不同的着色形式。蛋白质分子具有酰胺基结构，其和蛋白质通过分子间范德华键结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大吸收波长由465nm变成595nm，通过测定波长595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量[11-13]。

1.4 实验方法

1.4.1 考马斯亮蓝G-250的制备[14-15]

精确称取100.00mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%vol乙醇中，加入100mL85%的磷酸，用水稀释至1000mL。快速过滤后，放在棕色试剂瓶中避光保存。最终试剂中含0.1g/L考马斯亮蓝G-250，47g/L乙醇，85g/L磷酸。

1.4.2 标准蛋白质溶液的制备

结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯式定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/mL标准溶液。

1.4.3 供试样品溶液的制备

精确称取处理好的核桃粗蛋白粉0.5002g，加入蒸馏水溶解，在室温条件下搅拌浸提1h，然后3500r/min离心20min，过滤上清液。然后加少量蒸馏水对沉淀进行再次水提，操作条件与前者相同。合并2次所得的上清液，定容至100mL，备用。

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归方程建立

取9支试管，分别加入0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL的1mg/mL标准蛋白质溶液，补水至2.0mL。另取9支试管，分别加入0.1mL以上溶液，然后各加入5mL考马斯亮蓝试剂，充分振荡混合，10min后于波长595nm处，以0号管为空白，测定各管的吸光度值。以标准蛋白质浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

得其线性回归方程式：

Y=0.87249X-0.00056，R2=0.99964，r=0.99982

图1 蛋白质标准曲线Fig.1 Protein standard curve

2.2 供试样品中蛋白质含量的测定

取样品溶液0.1mL于试管中，各加入5mL考马斯亮蓝试剂，充分混合，放置10min，以试剂空白为对照，波长595nm处比色，测定吸光度值。同时做3个重复，测得吸光度值分别为0.372、0.377、0.345，计算蛋白质含量分别为8.54%、8.66%、7.92%，平均含量为8.37%。

2.3 稳定性实验

量取同一样品溶液0.1mL，每隔5min测定一次，观测其稳定性，结果见表1。

表1 稳定性实验结果Table 1 Results of stability experiment

由表1可知，在显色5min～25min内吸光度值比较稳定，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.67%，小于5%，表明稳定性较好。

2.4 精密度实验

精确吸取牛血清白蛋白溶液0.1mL进行精密度实验，连续测定其吸光度值6次，结果见表2。

表2 精密度实验结果Table 2 Results of precision experiment

由表2可知，RSD为1.62%，小于5%，表明精密度较好。

2.5 重现性实验

精确吸取来自同一批原料的试样，按样品测定方法，分别测定其吸光度值，结果见表3。

表3 重现性实验结果Table 3 Results of reproducibility experiment

由表3可知，RSD为2.36%，小于5%，表明重现性较好。

2.6 回收率实验

精确吸取已配制的样品溶液1mL，分别加入0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL蛋白质标准溶液，加蒸馏水补足至2.0mL，按照样品测定法测吸光度值，计算回收率，结果见表4。

表4 回收率实验结果Table 4 Results of recovery rate experiment

由表4可知，RSD为2.77%，小于5%，表明该方法准确度较高，实验方法可行。

3 结论

供试样品溶液中蛋白质含量为0.1mg/mL～0.8mg/mL内时，在25min之内用考马斯亮蓝染色法测定其中的蛋白质含量，方法简便快速、灵敏度高、重现性好，对设备要求低，是测定蛋白质的有效方法。

[1]王孝平，邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J].天津化工，2009，23（3）：40-41.

[2]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京：中国轻工业出版社，1997.

[3]刘小华，张美霞，于春梅，等.考马斯亮兰法测定壳聚糖中蛋白的含量[J].中国交通医学杂志，2006，20（2）：159-160.

[4]李 娟，张耀庭，曾 伟，等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.

[5]王卫国，吴 强，胡保坤，等.几种测定灰树花多糖中蛋白质含量方法的比较研究[J].中国食用菌，2003，22（1）：27-30.

[6]王爱军，王凤山，王友联，等.低浓度蛋白质含量测定方法的比较[J].中国生化药物杂志，2003，24（2）：78-80.

[7]王淡兮，孙秀兰.蛋白质定量检测方法的探讨[J].粮食与食品工业，2009（4）：49-52.

[8]陈晓梅，刘雅文，程 熠，等.考马斯亮蓝法蛋白定量标准曲线稳定性观察[J].中国公共卫生杂志，2006，22（3）：380-381.

[9]李闻捷，范华杰，蔡 刚.蛋白质定量方法的局限性及合理应用[J].临床检验杂志，2004，22（3）：210.

[10]CHIAL H J,THOMPSON H B,SPLITTGERBER A G.A spectral study of the charge forms of coomassie blue G250[J].Anal Biochem,2003,209(2):258-266.

[11]ZUO SS,LUNDAHL P A micro-Bradford membrane protein assay[J].Anal Biochem,2005,284(1):162-164.

[12]王文平，郭祀远，李 琳，等.考马斯亮蓝法测定野木瓜多糖中蛋白质的含量价[J].食品研究与开发，2008，29（1）：115-117.

[13]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976,72(1-2):248-254.

[14]王福荣.生物工程分析与检验[M].北京：中国轻工业出版社，2010.

[15]李建武.生物化学实验原理和方法[M].北京：北京大学出版社，1991.