榆耳高F值低聚肽的制备及氨基酸组成分析

常桂英，楚海娇，高桂凤，尹 锐

（1.吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 吉林 132101；2.酿造技术吉林省高等学校工程技术研究中心，吉林 吉林 132101）

榆耳（Gloeostereum incarnatum）属多孔菌目伏革菌科胶韧革菌，又称榆磨，是分布于我国长白山区的一种野生真菌。其子实体富含蛋白质、多糖及多种维生素，脂肪含量低，现已人工栽培生产。其浸出液对痢疾和肠胃系统疾病亦有奇效，是一种不可多得的集食用及药用于一体的珍贵食用菌品种[1]。F值是指在氨基酸混合物或寡肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸含量摩尔浓度比值[2]。高F值低聚肽可以改善肝功能[3-4]，缓解血液芳香族氨基酸浓度过高导致肝昏迷[5]；可以提供能量，缓解疲劳、可以改善手术后病人营养状态[6]，广泛应用于烧伤、外科手术等病人及消化酶缺失患者的肠道营养剂和蛋白营养食品[7]；也可用作高强度劳动者及运动员的食品营养剂，能及时补充能量、消除疲劳、增强体力[8]；还具有抗氧化活性及其良好风味等生物活性[9]。

本实验以榆耳为原料，测其蛋白质组成及制备高F值低聚肽，为菌类活性肽的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

榆耳子实体：由吉林农业科技学院食用菌研究所提供。

NH4Cl：北京康普惠维科技有限公司；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、1mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、氨基酸标准品、苯基芥子油、三乙胺：上海生化试剂厂；甘油、聚乙烯吡咯烷酮：上海德茂化工有限公司；苯酚：荆州市丽之源化工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-10AT氨基酸自动分析仪：北京温分分析仪器技术开发有限公司；756PC紫外/可见分光光度计：上海昂拉仪器有限公司；YP2001N电子天平：北京温分分析仪器技术开发有限公司；JL-UF超滤装置（超滤膜孔径10.6ku、2.0ku）：杭洲捷滤膜分离技术有限公司；SF-400高速万能粉碎机：上海超亿制药机械设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氨基酸组成分析

氨基酸标品处理：取200μL氨基酸标品于试管中，加100mmol/L苯基芥子油100μL，加1mol/L三乙胺100μL后，放在室温条件下衍生1h，向衍生液中加400μL正己烷洗涤，取下层溶液进样2μL，即得17种标准氨基酸色谱图。

榆耳蛋白质氨基酸水解液的制备及衍生处理：取60mg粉碎后的榆耳粉末，置于10mL 0.2%苯酚、6mol/L盐酸的溶液中，在110℃水解24h后取出，用0.1%盐酸定容，取200μL于试管中，加100mmol/L苯基芥子油100μL，加1mol/L三乙胺100μL后，放在室温下衍生1h，向衍生液中加400μL正己烷洗涤，取下层溶液进样2μL[10]。

1.3.2 蛋白质含量测定

蛋白质含量测定采用考马斯亮兰法[11]。

蛋白质标准溶液配制：用牛血清白蛋白配制成0.1mg/mL标准蛋白溶液。染色液配制：称取0.1g考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%磷酸100mL，蒸馏水定容至1L，贮存在棕色瓶中。

标准曲线制作：取8只试管，编号，按表1加入试剂，颠倒混匀后室温静置5min。以管1作空白对照，在波长595nm处比色测定。以标准蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标制作标准曲线，各管加液量见表1。

表1 蛋白质标准曲线制作加液量Table 1 Liquid adding volume for the protein standard curve

样品中蛋白质含量测定：取2只试管（平行测定）A和B，加入样品提取液1mL，考马斯亮蓝溶液5mL，测定方法同上，蛋白质含量计算公式：

式中：C为标准曲线上求出的蛋白质的量，mg；VT为提取液的总体积，mL；Vs为测定时的加样量，mL；WF为样品的量，mL。

1.3.3 榆耳蛋白质的提取与纯化

榆耳蛋白质的提取：称取10g样品放在研钵中，加入液氮进行研磨；加入蛋白质提取液（冰上预冷）300mL，冰上放置3h～4h。4℃，8000r/min离心40min，吸取上清液得到粗蛋白。

提取液配制（300mL）：1mol/LTris-HCL（pH 8.0）45mL，甘油75mL，聚乙烯吡咯烷酮6g，定容至300mL，在125℃、15min条件下高压灭菌。

榆耳蛋白质的纯化：①去多糖：将所得的榆耳蛋白提取液减压浓缩，并加入3倍体积的95%vol乙醇醇沉除去多糖，离心，将所得溶液减压浓缩除去乙醇，得到除去多糖的榆耳蛋白溶液。②盐析：向去多糖的蛋白质提取液中按氯化铵60g/200mL（固液比）缓慢加入氯化铵粉末，盐析后4℃静置过夜，待沉淀完全后再离心（4000r/min、40min），弃上清，沉淀用蒸馏水溶解。③透析：取10倍以上蛋白质体积的去离子水，将装好样品的透析袋悬于大烧杯中部。在烧杯底部放一个磁子，缓慢搅拌以促进溶液交换。更换洗脱溶液数次（约30min一次），至达到透析平衡为止（洗出液中无Cl-），得榆耳蛋白质提取液，冷冻干燥备用。

1.3.4 低聚肽的制备及F值分析

（1）低聚肽的制备：取1g蛋白质样品加20mL水溶解后，95℃条件下预热15min后快速冷却。然后加凝乳蛋白酶在50℃，pH9.0条件酶解4h，再加羧肽酶在50℃、pH 7.0条件下继续水解4h，加酶量均为4000U/g。酶解过程中用1mol/L HCl维持pH值恒定。酶解结束后，95℃沸水浴10min以钝化酶，快速冷却后调pH值至4.3，4000r/min离心15min。酶解上清液用截留分子量为10.6ku和2.0ku的改性聚醚酚平板超滤膜进行分级分离，收集10.6ku～2.0ku超滤膜的透过液，冷冻干燥，即得低聚肽粉[12-15]。

（2）F值分析：采用氨基酸自动分析仪测定低聚肽氨基酸组成及含量，根据支链氨基酸和芳香族氨基酸的含量进行F值计算，F值计算公式：

2 结果

2.1 标品氨基酸组成分析

17种标品氨基酸色谱图见图1。

图1 17种标品氨基酸色谱图Fig.1 Chromatogram of seventeen standard amino acids

2.2 榆耳蛋白质含量分析

按1.3.2方法，制作蛋白质标准曲线见图2。

按1.3.2方法测得榆耳蛋白质提取液吸光度值为0.793，经过计算，榆耳蛋白质含量为85.1μg/mL。

2.3 榆耳蛋白质、榆耳低聚肽氨基酸组成

通过对榆耳蛋白质、榆耳低聚肽氨基酸色谱分析，氨基酸的组成及含量见表2。

由表2可知，榆耳低聚肽中含有丰富的支链氨基酸—缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，含量占34.8%。检测出榆耳蛋白质中17种氨基酸，其中必需氨基酸有7种，占总氨基酸含量79.0%；榆耳低聚肽中必需氨基酸有7种，占总氨基酸含量47.7%。

图2 蛋白质标准曲线Fig.2 Standard curve of protein

表2 榆耳蛋白质、低聚肽中氨基酸组成及含量Table 2 Amino acids composition and its content inG.incarnatum protein and oligopeptide

2.4 榆耳蛋白质、低聚肽的F值分析

通过对榆耳蛋白质提取液、榆耳低聚肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸的含量分析，低聚肽的F值为22.67。榆耳蛋白质、榆耳低聚肽中支链氨基酸与芳香族氨基酸含量及F值见表3。

表3 榆耳中支链氨基酸与芳香族氨基酸的含量Table 3 Branched chain amino acid and aromatic amino acid content inG.incarnatum

3 结论

实验结果表明，榆耳蛋白质经提取、纯化、酶解，可获得高F值低聚肽，F值为22.67。本研究以食药用菌榆耳为原料，为功能型低聚肽提供一个新的材料来源，为菌物蛋白质的开发提供一个新的领域。

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