顺铂诱导宫颈癌细胞上皮间质转化的研究＊

杨 丞，饶 翔，丁莉利，王明华

（1.海南医学院病理教研室，海南海口571101；2海南省海口市人民医院病理科，海南海口570208）

上皮间质转化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程。近年有学者通过比较多种耐药细胞系和其亲本细胞系的形态和检测EMT标记性蛋白的表达，证实耐药细胞株发生EMT改变，并使细胞侵袭力增强［1］。但在化疗药物干预早期，EMT能否发生、发生的时间点及其与肿瘤细胞侵袭能力和耐药性之间的关系等问题，目前尚不清楚。本文通过体外细胞学实验研究，以低剂量短时间给药处理，详细观察顺铂诱导低分化宫颈癌HCE1细胞株EMT的时间点及其与肿瘤细胞侵袭能力和耐药性之间的关系，并明确Twist1是否为调控顺铂诱导宫颈癌细胞EMT的关键转录因子。

1 材料与方法

1.1 材料 实验细胞：人低分化宫颈癌HCE1细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心。主要试剂：高糖亚甲基双丙烯酰胺（dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM）培养基购自Gibco公司，新生牛血清购自杭州四季青公司，胰蛋白酶和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自Amersco公司，四甲基偶 氮 唑 盐 （3－（4，5）－dimethylthiahiazo（－z－y1）－3，5－di－phenytetrazoliumromide，MTT）试剂购自Sigma公司，Transwell小室购自Corning Coster公司，基底膜Matrigel购自BD Biosciences公司，顺铂（批号：H37021358）购自山东齐鲁制药厂，相对分子质量300.3Da。一抗抗体Vimentin、E－Cadherin、PGlycoprotein购自ProMab公司。二抗羊抗鼠／兔抗体免疫组织化学试剂盒购自迈新公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司，cDNA Synthesis Kit购自TOYOBO公司，PCR Master Mix（0.05units／uL Taq DNA Polymerase in reaction buffer，4 mmol MgCl2，0.4mmol dNTP）购自 Fermentas公司，DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司，AGAROSE购自AMRESCO公司，10×DNA上样缓冲液购自ProMab公司。PCR引物用Primer premier 5.0软件设计，由Invitrogen公司合成。引物序列及产物长度如下：Twist上游引物：5′－GAG TCC GCA GTC TTA CGA G－3′，下 游 引 物：5′－ATC CTC CAG ACC GAG AAG－3′，长度282bp；甘油醛－3－磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）上 游 引 物：5′－ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC －3′，下 游 引 物：5′－TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA－3′，长度450bp。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养并形态观察 以HCE1细胞株为对照组，加顺铂组（终浓度0.1mg／L）为实验组，分别以相同的细胞量接种到培养瓶，加入10%新生牛血清DMEM培养基置37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育，分别于24、48、72、96h等以倒置相差显微镜观察细胞形态并拍照，比较细胞形态差异，寻找顺铂诱导细胞EMT的时间点。

1.2.2 细胞生长曲线测定方法 待以上细胞长至对数生长期，用胰酶消化后重悬并进行细胞计数，在96孔板每孔加入100μL（104／mL）细胞，各设3个平行孔，置37℃5%CO2细胞培养箱培养，待24h后吸取实验组培养液加入100μL含顺铂的培养液（终浓度0.1mg／L）。再过24h每孔加10μL MTT（5g／L），37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续孵育4h后弃上清液，每孔再加200μL DMSO，出现蓝紫色颗粒结晶并充分溶解后于570nm处测光密度（OD）值，连续6d。然后以OD值为纵轴，时间为横轴绘制细胞生长曲线，比较生长趋势差异。

1.2.3 细胞免疫组织化学检测方法 以HCE1细胞株为对照组，在EMT时间点的细胞为EMT组，取生长状态良好的细胞玻片，D－Hank′s缓冲液清洗2次，于固定液固定10min，1×PBS缓冲液（0.01mol／L，pH 7.2）洗涤细胞片5min×3次，3%H2O2室温孵育10min，再用1×PBS缓冲液洗涤5min×3次；滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液体，滴加一抗50μL，4℃过夜；1×PBS缓冲液洗涤5min×3次，滴加复合二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG），室温静置20 min，1×PBS洗涤5min×3次；二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色约4min，浸入自来水终止显色，苏木精复染，乙醇分化1s，自来水冲洗15min，入乙醇脱水二甲苯透明；中性树胶封片，镜检。比较两组细胞阳性染色差异。

1.2.4 肿瘤细胞侵袭实验方法 用50mg／L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干；消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗涤2遍，用含牛血清白蛋白的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104／mL；Transwell小室6孔板下室加入1mL含胎牛血清（Fetal calf serum，FBS）的培养基，上室加入细胞悬液，每组设3个平行孔，培养细胞24h。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用95%乙醇固定15min，苏木素染色10min，200倍光镜视野下计数5个视野，计算平均细胞穿孔数。

1.2.5 半定量RT－PCR检测Twist1表达方法 每组取107个细胞加入1mL Trizol试剂消化，室温静置5min后加入0.2 mL氯仿，震荡15s后在4℃下12 000r／min离心15min，将水样层转移至干净的试管，加入0.5mL异丙醇，混匀后－20℃下静置15min，在4℃下12 000r／min离心10min，移去上层悬液，将RNA沉淀用1mL 75%乙醇洗涤，在振荡器上混匀后4℃下7 500r／min离心5min，弃去上清液。适度干燥RNA沉淀后，加入适量0.1%焦磷酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水，使RNA完全溶解。2 000r／min离心20s。紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，评估RNA纯度。逆转录体系如下：总RNA 1μL，Oligo（dT）20（0.01mol／L）1μL，无 RNase水10μL，5×RT Buffer 4μL，dNTP混合物（0.01mol／L）2μL，RNase抑制剂（10u／μL）1μL，逆转录酶1μL，在42℃反应20min，99℃反应5min，4℃反应5min，即完成cDNA第一链合成。PCR反应体系如下：cDNA模板1μL，引物（10μmol／L）1μL，PCR Master混合液（成分见材料）12.5μL，PCR缓冲液10.5μL，在95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸5min。取8μL PCR产物加入2μL上样缓冲液中于1.5%的琼脂糖凝胶上电泳（90v30min），用VDS凝胶成像仪摄影后进行灰度扫描，计算各扩增产物与GADPH的比值。重复3次。

1.3 统计学处理 利用SPSS13.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态 分别于24、48、72、96h在显微镜下比较两组细胞的形态，发现实验组细胞在72h发生EMT的形态改变：连接紧密的细胞变得扁平，更趋于梭形，且失去了大部分细胞连接（图1）。72h即为HCE1发生EMT的时间点。

图1 两组72hHCE1细胞形态（倒置显微镜×100）

2.2 细胞生长曲线 实验组细胞生长趋势于72h前稍慢于对照组，72h后生长趋势逐渐与对照组接近，96h后两组细胞均进入平台期，生长趋势基本重合，见图2。

2.3 细胞免疫组织化学检测结果 细胞黏附分子（E－cadharin）定位于细胞膜和细胞间桥处，对照组高表达，EMT组表达减少；vimentin定位于细胞膜及细胞质处，对照组有表达，EMT组表达增加；P糖蛋白（P－gp）定位于细胞膜及细胞质处，对照组有表达，EMT组表达增加，见图3。

2.4 肿瘤细胞侵袭结果 对照组HCE1细胞的平均穿膜细胞数为（39.000 0±2.828 4）个，EMT组HCE1的平均穿膜细胞数为（100.166 7±3.868 7）个，EMT组较对照组细胞多，侵袭能力EMT组强于对照组，其差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图2 宫颈癌细胞株HCE1MTT生长曲线

图3 两组HCE1细胞标志蛋白的免疫组织化学检测（SP法×200）

图4 两组HCE1细胞侵袭能力检测（倒置显微镜×200）

图5 PCR产物的电泳结果

2.5 半定量RT－PCR检测Twist1表达 对照组HCE1总RNA A260／A280为1.873 0，EMT组为1.904 0。对照组各条带OD值与内参OD比值为0.200 2±0.000 9，EMT组为0.615 6±0.005 1，EMT组Twist1表达比对照组增强，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

3 讨 论

EMT是胚胎发育中形态生发的一个关键过程，以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征，具体包括：细胞黏附分子（E－cadherin）表达减少；角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架，从而引起细胞形态的改变［2］。

本实验研究显示，宫颈癌HCE1细胞经过低剂量顺铂处理72h可发生EMT的形态变化，上皮细胞标志性蛋白E－cadherin表达减少、间质细胞标志蛋白Vimentin表达增强进一步证明EMT的发生。从生长曲线来看，生长曲线趋势72h前实验组慢于对照组，提示顺铂对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，引起细胞的凋亡，72h后生长趋势逐渐接近并与对照组重合，说明顺铂诱导宫颈癌细胞发生EMT后，细胞生长速度会增快，因此，低剂量顺铂诱导宫颈癌细胞发生EMT是一个早期事件。

顺铂是宫颈癌化疗的一线药物，但宫颈癌细胞对化疗药物获得性耐药是化疗失败的主要原因，尤其用小剂量化疗药物诱导宫颈癌细胞，更易导致耐药的产生［3］。近年研究表明，多药耐药基因1（multi－drug resistance gene 1，MDR－1）编码的 P－gp的过表达与多药耐药（multi－drug resistance，MDR）发生有关［4］，而P－gp蛋白表达升高的肿瘤细胞具有增强的侵袭转移能力，提示化疗药物诱导肿瘤细胞耐药性和侵袭性增强之间存在内在联系［5－6］。最近的研究证实肿瘤的侵袭转移、多药耐药还与EMT相关［7－8］。本实验显示EMT组HCE1细胞体外侵袭能力增强，P－gp蛋白表达增强，也从细胞生物学特性上证实低剂量顺铂诱导宫颈癌细胞HCE1发生了EMT。从上可知化疗药物在治疗早期诱导EMT是使宫颈癌化疗失败的关键性原因。因此，早期阻止EMT的发生，对防止形成耐药性、降低转移的风险有重要意义。

本实验中顺铂诱导宫颈癌细胞HCE1发生EMT后，Twist1表达明显高于EMT前，可以证实Twist1与宫颈癌细胞EMT的发生密切相关，是调节顺铂诱导HCE1发生EMT的关键转录因子。而碱性螺旋－环－螺旋家族的转录因子Twist，已 被 证 实 在 胃 癌［9－10］、乳 腺 癌［11－12］、前 列 腺 癌［13］、肝癌［14］这些实体肿瘤存在过表达，Twist表达的升高还与肿瘤的分期、预后有关［15］。本研究结果提示，针对Twist的基因抑制在宫颈癌化疗中可望产生协同作用，为提高临床肿瘤化疗效果提供一种新思路。

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